Biopolym. Cell. 2020; 36(5):329-340.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000A37
Структура та функції біополімерів
Виділення та характеристика мутантної форми N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази Bos taurus з заміною Trp 40 та Trp 283 на аланін
1Заєць В. М., 1Ложко Д. М., 2Цуварєв О. Ю., 1Коломієць Л. А., 2Зуб П. Е., 1Корнелюк О. І.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143
  2. Інститут високих технологій,
    Київський національний університет імені Тараса Шевченка
    пр. Академіка Глушкова 2, кор. 5, Київ, Україна, 03022

Abstract

Мета. Отримання мутантної однотриптофанової форми N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази Bos taurus (міні TyrRS) для моніторингу локальних конформаційних змін методом флуоресцентної спектроскопії. Методи. Бактеріальна експресія, метал-хелатуюча хроматографія, гель-електрофорез, флуоресцентна спектроскопія, комп’ютерне моделювання. Результати. Проведено заміну двох триптофанових кодонів кодонами аланіна в кДНК, що кодує міні BtTyrRS. Ці мутації не впливають на синтез та розчинність міні BtTyrRS в штамі E. coli BL21 (DE3) pLysE. Кількість розчинної форми мутантної міні BtTyrRS в цитоплазмі бактеріальних клітин при інкубації бактеріальної культури при 25 ° С становило близько 47% від загальної кількості рекомбінантного білка. Комп`ютерне моделювання та флуоресцентне дослідження однотриптофанової форми міні BtTyrRS показало, що залишок Trp 87 локалізований в області димеризації субодиниць ферменту. Характеристики флуоресценції триптофану мутантного міні BtTyrRS вказують на те, що Trp 87 локалізований в іммобілізованому мікросередовищі інтерфейсу димера. Висновки. Встановлено оптимальні умови бактеріальної експресії мутантної форми міні BtTyrRS, що містить Trp 87, в культурі бактерій E. coli штаму BL21 (DE3) pLysE. Trp 87-вмісна форма міні BtTyrRS може бути використана для моніторингу локальних конформаційних змін в інтерфейсі димера фермента.
Keywords: тирозил-тРНК синтетаза, міні TyrRS, бактеріальна експресія, флуоресцентна спектроскопія, комп’ютерне моделювання
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Pang YL, Poruri K, Martinis SA. tRNA synthetase: tRNA aminoacylation and beyond. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2014;5(4):461-80.
[2] Kornelyuk AI. Structural and functional investigation of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase. Biopolym Cell. 1998; 14(4):349–59.
[3] Korneliuk AI, Kurochkin IV, Matsuka GKh. Tirozil-tRNK-sintetaza iz pecheni byka. Vydelenie i fiziko-khimicheskie svoĭstva [Tyrosyl-tRNA synthetase from the bovine liver. Isolation and physico-chemical properties]. Mol Biol (Mosk). 1988;22(1):176-86. Russian.
[4] Gnatenko DV, Korneliuk AI, Kurochkin IV, Ribkinska TA, Matsuka GKh. Vydelenie i kharkteristkia funktsional'no aktivnoĭ proteoliticheski modifitsirovannoĭ formy tirozil-tRNK-sintetazy iz pecheni byka [Isolation and characteristics of functionally active proteolytically modified forms of tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver]. Ukr Biokhim Zh (1978). 1991;63(4):61-7. Russian.
[5] Kornelyuk AI, Tas MPR, Dubrovsky AL, Murray JC. Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase. Biopolym Cell. 1999;15(2):168-72.
[6] Levanets OV, Naidenov VG, Odynets KA, Woodmaska MI, Matsuka GKh, Kornelyuk AI. Homology of C-terminal non-catalytic domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase with cylokine EMAP II and non-catalytic domains of methionyl- and phenylalanyl-tRNA synthetases. Biopolym Cell. 1997;13(6):474-478.
[7] Wakasugi K, Schimmel P. Highly differentiated motifs responsible for two cytokine activities of a split human tRNA synthetase. J Biol Chem. 1999;274(33):23155-9.
[8] Guo M, Schimmel P. Essential nontranslational functions of tRNA synthetases. Nat Chem Biol. 2013;9(3):145-53.
[9] Kondratyuk Yu, Babarik M, Sidorik L, Kornelyuk O. Optimization of the process of biosynthesis of the catalytic module of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase and its research by immunochemical methods. Bull Kyiv Taras Shevchenko Natl Univ, Biol ser. 2010; 56: 33–5.
[10] Zayets VN, Tsuvarev AYu, Kolomiiets LA, Korneliuk AI. Site-directed mutagenesis of tryptophan residues in the structure of the catalytic module of Tyrosyl-tRNA Synthetase from Bos taurus. Cytol Genet. 2019;53(3):219–26.
[11] Sahdev S, Khattar SK, Saini KS. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem. 2008;307(1-2):249-64.
[12] Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172.
[13] Joseph BC, Pichaimuthu S, Srimeenakshi S, Murthy M, Selvakumar K, Ganesan M, Manjunath SR. An overview of the parameters for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Cell Sci Ther. 2015; 6(5)
[14] Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990;96(1):23-8.
[15] Sambrook J, Fritsch T, Manniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2th ed. New York: “Cold Spring Harbor Laboratory Press”, 1989.
[16] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5.
[17] Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 2004;25(13):1605-12.
[18] Waterhouse A, Bertoni M, Bienert S, Studer G, Tauriello G, Gumienny R, Heer FT, de Beer TAP, Rempfer C, Bordoli L, Lepore R, Schwede T. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W296-W303.
[19] Xu D, Zhang Y. Improving the physical realism and structural accuracy of protein models by a two-step atomic-level energy minimization. Biophys J. 2011;101(10):2525-34.
[20] Chen VB, Arendall WB 3rd, Headd JJ, Keedy DA, Immormino RM, Kapral GJ, Murray LW, Richardson JS, Richardson DC. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(Pt 1):12-21.
[21] Reshetnyak YK, Burstein EA. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins. Biophys J. 2001;81(3):1710-34.
[22] Turoverov KK, Kuznetsova IM. Sobstvennaia fluorestsentsiia globuliarnogo aktina. Osobennosti lokalizatsii triptofanovykh ostatkov [Intrinsic fluorescence of globular actin. Features of localization of tryptophan residues]. Bioorg Khim. 1998;24(12):893-8.
[23] Studier FW, Moffatt BA. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 1986;189(1):113-30.
[24] Papaneophytou CP, Kontopidis G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: a general review. Protein Expr Purif. 2014;94:22-32.
[25] Yang XL, Skene RJ, McRee DE, Schimmel P. Crystal structure of a human aminoacyl-tRNA synthetase cytokine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(24):15369-74.
[26] Kravchuk VO, Savytskyi OV, Odynets KO, Mykuliak VV, Kornelyuk AI. Computational modeling and molecular dynamics simulations of mammalian cytoplasmic tyrosyl-tRNA synthetase and its complexes with substrates. J Biomol Struct Dyn. 2017;35(13):2772-2788.
[27] Chysta SV, Kornelyuk AI. Fluorescence and dynamics of the microenvironment of tryptophan residues of eukaryotic tyrosyl-tRNA synthetase. Fizyka Zhyvogo. 2014; 21(1-2):24–8.
[28] Nangle LA, Zhang W, Xie W, Yang XL, Schimmel P. Charcot-Marie-Tooth disease-associated mutant tRNA synthetases linked to altered dimer interface and neurite distribution defect. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(27):11239-44.
[29] Odynets KA, Kornelyuk AI. Bioinformatical analysis of influence of human tyrosyl-tRNA synthetase mutations associated with neuropathy Charcot-Marie-Tooth, type C, on its local spatial structure properties. Biopolym Cell. 2007;23(5):449–60.