Biopolym. Cell. 2020; 36(2):110-121.
Структура та функції біополімерів
Зміни експресії ізоформ S6K1 у клітинах лінії MCF-7 мають сильний вплив на рухливість, а також на S6K1 і Akt сигналінг
- Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143
Abstract
Мета. Створити клітинні лінії MCF-7 з вибірковою експресією p85, p70 та p60 ізоформ S6K1: p85-/p70-/p60 – MCF-7 та p85-/p70-/p60+ MCF-7. Методи. CRISPR/cas9 система редагування генома, вестерн-блот аналіз, імунофлуоресцентний аналіз, метод «раневої поверхні». Результати. Створено модифіковані клітини лінії MCF-7 з заблокованою експресією p85, p70, p60 чи тільки p85 та p70 ізоформ S6K1. Продемонстровано, що вибіркове інгібування експресії лише p85 та p70 ізоформ S6K1 в клітинах p85-/p70-/p60+MCF-7 супроводжується перебудовами актинового цитоскелету, появою клітин фібробласто-подібного фенотипу та суттєвим підвищенням міграційної активності клітин. Однак, пригнічення експресії всіх трьох ізоформ в клітинах p85-/p70-/p60 – MCF-7 негативно впливало на міграцію клітин и не мало впливу на клітинну морфологію. В той же час зміни в експресії ізоформ S6K1 мали різний вплив на фосфорилювання рибосомного білка S6 та Akt cигналювання. Висновок. Аналіз створених модифікованих клітин лінії MCF-7 дозволив виявити різний вплив експресії ізоформ S6K1 на локомоторну активність клітин та на S6K1 – та Akt-залежне сигналювання. Відповідно до представлених даних, серед досліджуваних ізоформ S6K1 саме p60-S6K1 може бути залученою до регуляції міграції клітин. Модифіковані клітинні лінії MCF-7 надалі можуть бути використані для подальшого дослідження функціональної активності ізоформ S6K1.
Keywords: mTOR/S6K1 сигналювання, MCF-7, S6K1, CRISPR/Cas9, рак молочної залози
Повний текст: (PDF, англійською)
References
[1]
Fedorenko Z, Michailovich Y, Goulak L, Gorokh Y, Ryzhov A, Soumkina O, Koutsenko L. Cancer in Ukraine, 2018-2019. Incidence, mortality, activities of oncological service. Bulletin of National Cancer Registry of Ukraine. 2020;21:1-10.
[2]
Takahashi H, Isogawa M. Management of breast cancer brain metastases. Chinese Clinical Oncology. 2018;7(3):30.
[3]
Fruman D, Chiu H, Hopkins B, Bagrodia S, Cantley L, Abraham R. The PI3K pathway in human disease. Cell. 2017;170(4):605-35.
[4]
Filonenko V. PI3K/mTOR/S6K signaling pathway - new players and new functional links. Biopolym Cell. 2013;29(3):207-14.
[5]
Castellvi J, Garcia A, Rojo F, Ruiz-Marcellan C, Gil A, Baselga J, Ramon y Cajal S. Phosphorylated 4E binding protein 1: a hallmark of cell signaling that correlates with survival in ovarian cancer. Cancer. 2006; 107(8):1801-11.
[6]
Filonenko VV, Tytarenko R, Azatjan SK, Savinska LO, Gaydar YA, Gout IT, Usenko VS, Lyzogu-bov VV. Immu-nohistochemical analysis of S6K1 and S6K2 localization in human breast tumors. Exp Oncol. 2004; 26(4):294-9.
[7]
Lyzogubov V, Khozhaenko Y, Usenko V, Antonjuk S, Ovcharenko G, Tikhonkova I, Filonenko V. Immunohisto-chemical analysis of Ki-67, PCNA and S6K1/2 expression in human breast cancer. Exp Oncol. 2005; 27(2):141-4.
[8]
Barlund M, Forozan F, Kononen J, Bubendorf L, Chen Y, Bittner ML, Torhorst J, Haas P, Bucher C, Sauter G, Kallioniemi OP, Kallioniemi A. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 2000: 92(15):1252-9.
[9]
van der Hage JA, van den Broek LJ, Legrand C, Clahsen PC, Bosch CJ, Robanus-Maandag EC, van de Velde CJ, van de Vijver MJ. Overexpression of P70 S6 kinase protein is associated with increased risk of locoregional re-currence in node-negative premenopausal early breast cancer patients. Br J Cancer. 2004; 90(8):1543-50.
[10]
Bostner J, Karlsson E, Pandiyan MJ, Westman H, Skoog L, Fornander T, Nordenskjöld B, Stål O. Activation of Akt, mTOR, and the estrogen receptor as a signature to predict tamoxifen treatment benefit. Breast Cancer Res Treat. 2013; 137(2):397-406.
[11]
Bostner J, Karlsson E, Eding CB, Perez-Tenorio G, Franzén H, Konstantinell A, Fornander T, Nordenskjöld B, Stål O. S6 kinase signaling: tamoxifen response and prognostic indication in two breast cancer cohorts. Endocr Relat Cancer. 2015; 22(3):331-43.
[12]
Barlund M, Monni O, Kononen J, Cornelison R, Torhorst J, Sauter G, Kallioniemi O, Kallioniemi A. Multiple genes at 17q23 undergo amplification and overexpression in breast cancer. Cancer Res. 2000; 60(19):5340-4.
[13]
Ismail HM. Overexpression of S6 kinase 1 in brain tumours is associated with induction of hypoxia-responsive genes and predicts patients' survival. J Oncol. 2012; 2012:416927.
[14]
Bostner J, Karlsson E, Pandiyan MJ, Westman H, Skoog L, Fornander T, Nordenskjöld B, Stål O. Activation of Akt, mTOR, and the estrogen receptor as a signature to predict tamoxifen treatment benefit. Breast Cancer Res Treat. 2013; 137(2):397-406.
[15]
Bostner J, Karlsson E, Eding CB, Perez-Tenorio G, Franzén H, Konstantinell A, Fornander T, Nordenskjöld B, Stål O. S6 kinase signaling: tamoxifen response and prognostic indication in two breast cancer cohorts. Endocr Relat Cancer. 2015; 22(3):331-43.
[16]
Fingar DC, Richardson CJ, Tee AR, Cheatham L, Tsou C, Blenis J. mTOR controls cell cycle progression through its cell growth effectors S6K1 and 4E-BP1/eukaryotic translation initiation factor 4E. Mol. Cell. Biol. 2004;24(1):200-16.
[17]
Chiang GG and Abraham RT. Phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) at Ser-2448 is me-diated by p70S6 Kinase. J. Biol. Chem. 2005;280(27):25485-90.
[18]
Liu L, Cardelli JA, Martin KA, Blenis J, Huang S. Rapamycin inhibits cell motility by suppression of mTOR-mediated S6K1 and 4E-BP1 pathways. Oncogene. 2006;25(53):7029-40.
[19]
Kim D, Akcakanat A, Singh G, Sharma C, Meric-Bernstam F. Regulation and localization of ribosomal protein S6 kinase 1 isoforms. Growth Factors. 2009;27(1):12-21.
[20]
Rosner M, Hengstschläger M. Nucleocytoplasmic localization of p70 S6K1, but not of its isoforms p85 and p31, is regulated by TSC2/mTOR. Oncogene. 2011;30(44):4509-22.
[21]
Zaiets I, Holiar V, Sivchenko A, Smialkovska V, Filonenko V. p60-S6K1 represents a novel kinase active isoform with the mode of regulation distinct from p70/p85-S6K1 isoforms. Ukr. Biochem. J. 2019;91(4):17-25.
[22]
Zaiets I, Sivchenko A, Khoruzhenko A, Filonenko V. Generation of HEK-293 stable cell lines with disrupted ex-pression of ribosomal protein S6 kinase (S6K1) isoforms using the CRISPR/Cas9 genome editing system. Biopolym Cell. 2017;33(5):356-66.
[23]
Zaiets I, Sivchenko A, Khoruzhenko A, Savinska L, Filonenko V. The p60-S6K1 isoform of ribosomal protein S6 kinase 1 is a product of alternative mRNA translation. Ukr Biochem J. 2018;90(4):25-35.
[24]
Zaiets IV, Holiar VV, Sivchenko AS, Smialkovska VV, Filonenko VV. p60-S6K1 represents a novel kinase active isoform with the mode of regulation distinct from p70/p85-S6K1 isoforms. Ukr Biochem J. 2019; 91(4):17-25
[25]
Savinska L, Kijamova R, Pogrebnoy P, Ovcharenko G, Gout I, Filonenko V. Comparative characterization of S6 kinase α and β isoforms expression in mammalian tissues. Biopolym Cell. 2001;17(5):374-9.
[26]
Gotsulyak N, Kosach V, Cherednyk O, Tykhonkova I, Khoruzhenko A. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolym Cell. 2014;30(3):223-8.
[27]
Comsa S, Cimpean A, Raica M. The Story of MCF‑7 Breast Cancer Cell Line: 40 years of Experience in Research. Anticancer Res. 2015;35(6):3147-54.
[28]
Berven L, Willard F, Crouch M. Role of the p70(S6K) pathway in regulating the actin cytoskeleton and cell mi-gration. Exp Cell Res. 2004;296(2):183-95.
[29]
Chiang GG and Abraham RT. Phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) at Ser-2448 is me-diated by p70S6 Kinase. J. Biol. Chem. 2005;280(27):25485-90.
[30]
Liu L, Cardelli JA, Martin KA, Blenis J, Huang S. Rapamycin inhibits cell motility by suppression of mTOR-mediated S6K1 and 4E-BP1 pathways. Oncogene. 2006;25(53):7029-40.
[31]
Saxton RA, Sabatini DM. mTOR Signaling in Growth, Metabolism, and Disease. Cell. 2017; 168:960-7.
