Biopolym. Cell. 2015; 31(4):285-293.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.0008ED
Молекулярна та клітинна біотехнології
Отримання та аналіз трансгенних рослин моркви та селери, здатних експресу вати рекомбінантний білок тауматин ІІ
1Лучаківска Ю. С., 1Комарницький І. К., 2Курченко І. М., 2Юр'ева О. М., 2Житкевич Н. В., 1Кучук М. В.
  1. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
    вул. Академіка Заболотного, 148, Київ, Україна, 03680
  2. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України
    вул. Академіка Заболотного, 154, Київ, Україна, 03680

Abstract

Мета Отримати трансгенні рослини моркви та селери, що експресують рекомбінантний тауматин ІІ, з метою підвищення стресостійкості цих культур. Методи. Для отримання трансгенних рослин проводили Agrobacterium-опосередковану трансформацію. Присутність та транскрипцію трансгенів підтверджували за допомогою ПЛР та ЗТ-ПЛР аналізів. Визначали стійкість отриманих рослин до біотичних стрес-факторів (аналіз антибактеріальної/антифунгальної активності in vitro) та до дії сольового/осмотичного стресу (тест на виживання рослин в присутності NaCl/ПЕГ у різних концентраціях). Результати. Трансгенні рослини моркви та селери, що експресують ген тауматину ІІ (транскрипцію підтверджено для 60–100 %) було отримано шляхом агро бактеріальної трансформації. Екстракти трансгенних рослин моркви інгібували ріст досліджуваних штамів фітопатогенних бактерій, але не проявляли антифунгальної активності. Рівень виживання трансгенних рослин при абіотичному стресі був значно вищим у порівнянні з нетрансгенними рослинами. Аналіз вмісту фотосинтетичних пігментів не показав достовірної різниці показників для трансгенних рослин при сольовому стресі, що може вказувати на можливу захисну активність рекомбінантного білка. Вис­новки. Отримані у наших дослідженнях трансгенні рослини селери та моркви, що експресують рекомбінантний тауматин II, характеризувались антибактеріальною активністю та підвищеною стійкістю до сольового та осмотичного стресу.
Keywords: морква, селера, тауматин ІІ, Agrobac­te­rium-опосередкована трансформація, стресостійкість.
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Parvaiz A, Satyawati S. Salt stress and phytobiochemical responses of plants – a review. Plant Soil Environ. 2008;54(3):89–9
[2] Rajam MV, Chandola N, Saiprasad Goud P, Singh D, Kashyap V, Choudhary ML, Sihachakr D. Thaumatin gene confers resistance to fungal pathogens as well as tolerance to abiotic stresses in transgenic tobacco plants. Biol Plant.2007; 51(1):135–41.
[3] Chen W, Punja Z. Transgenic herbicide- and disease-tolerant carrot (Daucus carota L.) plants obtained through Agrobacterium-mediated transformation. Plant Cell Rep. 2002; 20(10): 929–35.
[4] Schestibratov KA, Dolgov SV. Transgenic strawberry plants expressing a thaumatin II gene demonstrate enhanced resistance to Botrytis cinerea. Sci Hortic. 2005; 106(2): 177–89.
[5] Hu X, Reddy AS. Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis: inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein. Plant Mol Biol. 1997;34(6):949-59.
[6] Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962; 15(3):473–97.
[7] Komarnytskii I, Shcherbak N, Kishchenko E. Plant genetic transformation by vector with thaumatin II gene. Re­cent Advances in Plant Genetic Engineering. Kyiw, 2011
[8] Luchakivska Yu, Komarnitskii I, Kuchuk M. Obtaining of transgenic carrot (Daucus carota L.) and celery (Apium graveolens L.) plants expressing the recombinant gene of thaumatin II protein. In Vitro Cell Dev Biol. 2012; 48(4):2069.
[9] Gamborg OL, Miller RA, Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 1968;50(1):151-8.
[10] Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 1990; 12:13–5
[11] Draper J, Scott R. Armitage Ph. Plant genetic transformation and gene expression. A laboratory manual. Moscow: Mir, 1991. 780 p.
[12] Lipp João KH, Brown TA. Enhanced transformation of tomato co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif(r)::pGSFR1161 in the presence of acetosyringone. Plant Cell Rep. 1993;12(7-8):422-5.
[13] Logemann J, Schell J, Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal Biochem. 1987;163(1):16-20.
[14] Methods of experimental mycology. Kiev: Naukova dumka, 1982; 550 p.
[15] Bilai VI. Fusaria. Kyiv, Naukona dumka, 1977; 443 p.
[16] Domsch KH, Gams W, Anderson T-H. Compendium of soil fungi. Eching: IHW-Verlag, 2007. 672 p.
[17] Klochenko PD, Elanskaya I, Shevchenko T, Sokolova E. Antifungal activity of freshwater cyanobacteria. Algol Stud. 2001; 103:143–9.
[18] Hoffmann WA, Poorter H. Avoiding bias in calculations of relative growth rate. Ann Bot. 2002;90(1):37-42.
[19] Rees M, Osborne CP, Woodward FI, Hulme SP, Turnbull LA, Taylor SH. Partitioning the components of relative growth rate: how important is plant size variation? Am Nat. 2010;176(6):E152-61.
[20] Wellburn AR. The Spectral determination of chlorophylls A and B, as well as total carotenoids, using various so­lvents with spectrophotometers of different resolution. J Plant Physiol. 1994; 144(3):307–13.
[21] Gilbert MO, Zhang YY, Punja ZK. Introduction and expression of chitinase encoding genes in carrot following Agrobacterium-mediated transformation. In Vitro Cell Dev Boil. Plant. 1996; 32(3):171–8
[22] Takaichi M, Oeda K. Transgenic carrots with enhanced resistance against two major pathogens, Erysiphe heraclei and Alternaria dauci. Plant Sci. 2000;153(2):135-144.
[23] Kishchenko E, Shcherbak N, Kyrychuk Y, Kuchuk N. Construction of transgenic plants expressing tuberculosis-specific proteins. Abstracts of the 2d meeting of Ukrainian cell biologists organisation. Kyiv, 2007: 32.
[24] Song GQ, Loskutov AV, Sink KC. Highly efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of celery (Apium graveolens L.) through somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2007; 88(2):193–200.
[25] Witty M, Harvey WJ. Sensory evaluation of transgenic Solanum tuberosum producing r-thaumatin II. N Z J Crop Hortic Sci. 1990; 18(2–3):77–80.
[26] Bartoszewski G, Niedziela A, Szwacka M, Niemirowicz-Szczytt K. Modification of tomato taste in transgenic plants carrying a thaumatin gene from Thaumatococcus daniellii Benth. Plant Breed. 2003; 122(4):347–51. 1. Parvaiz A, Satyawati S. Salt stress and phytobiochemical responses of plants – a review. Plant Soil Environ. 2008;54(3):89–9.
[27] Szwacka M, Krzymowska M, Osuch A, Kowalczyk ME, Malepszy S. Variable properties of transgenic cucumber plants containing the thaumatin II gene from Thaumatococcus daniellii. Acta Physiol Plant. 2002;24(2):173–85.
[28] Dolgov SV, Lebedev VG, Firsov AP, Taran SA, Tjukavin GB. Expression of thaumatin II gene in horticultural crops. Genetics and Breeding for Crop Quality and Resistance. 1999;165–72.
[29] Safavi K,Zareie R, Tabatabaie BES. Expression of TLP-3 gene without signal peptide in tobacco plants using Agrobacterium mediated transformation. Afr J Biotechnol. 2011; 10(24):4816–22
[30] Zamani A, Motallebi M, Jonoubi P, Ghafarian-Nia NS, Zamani MR. Heterologous expression of the Secale cereale thaumatin-like protein in transgenic canola plants enhances resistance to stem rot disease. Iran J Biotechnol. 2012;10(2):87–95.
[31] Datta K, Velazhahan R, Oliva N, Ona I, Mew T, Khush GS, Muthukrishnan S, Datta SK. Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5) gene in transgenic rice plants enhances environmental friendly resistance to Rhizoctonia causing sheath blight disease. Theor Appl Genet. 1999; 98(6–7):1138–45.
[32] Mahdavi F, Sariah M, Maziah M. Expression of rice thaumatin-like protein gene in transgenic banana plants enhances resistance to fusarium wilt. Appl Biochem Biotechnol. 2012;166(4):1008-19.
[33] Patyka V, Gnatyuk T, Zhitkevych N, Aleksaev O. Sensitivity to pesticides of the number of representatives of the bacterial microbiota soybean. Nauk Zapys Ternop Nats Ped Univer, (Ser. Biol). 2014; 3 (60): 153–5
[34] Kitajima S, Sato F. Plant pathogenesis-related proteins: molecular mechanisms of gene expression and protein function. J Biochem. 1999;125(1):1-8.
[35] Parida AK, Das AB. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Ecotoxicol Environ Saf. 2005;60(3):324-49.
[36] Mane AV, Karadge BA, Samant JS. Salinity induced changes in photosynthetic pigments and polyphenols of Cymbopogon Nardus (L.) Rendle J Chem Pharm Res. 2010;2(3):338–47.
[37] Mehta P, Jajoo A, Mathur S, Bharti S. Chlorophyll a fluorescence study revealing effects of high salt stress on Pho­tos­ys­tem II in wheat leaves. Plant Physiol Biochem. 2010; 48 (1):16–20.