Biopolym. Cell. 2011; 27(6):436-441.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000114
Структура та функції біополімерів
Молекулярне клонування, секвенування і експресія в клітинах Escherichia coli лейцил-тРНК синтетази Thermus thermophilus
1, 2Яремчук Г. Д., 1Коваленко О. П., 1Гудзера О. І., 1, 2Тукало М. А.
  1. Державна ключова лабораторія молекулярної і клітинної біології
    Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  2. ЄМБЛ
    вул. Жюлі Горовиць, 6, Гренобль, Франція

Abstract

Мета. Клонування і секвенування лейцил-тРНК синтетази T. thermophilus (ЛейРСТТ) з наступним створенням генно-інженерної конструкції для експресії білка в клітинах E. coli та його виділення. Методи. Пошук гена ЛейРСТТ проводили методом Саузерн-блот-гібридизації з хромосомною ДНК, зондами слугували мічені дигоксигеніном ПЦР-фрагменти ДНК. Результати. Ген ЛейРС з клітин T. thermophilus HB27 клоновано і секвеновано. Відкрита рамка зчитування кодує поліпептид довжиною 878 амінокислотних залишків (молекулярна маса 101 кДа). Порівняння амінокислотної послідовності ЛейРСТТ з послідовностями гомологічних ферментів з інших організмів показало, що вона входить до групи аналогічних ферментів прокаріотів, c сформованої білками протобактерий, риккетсій, а також мітохондрій еукаріотів. Одержане філогенетичне дерево ЛейРС демонструє дихотомічне розгалуження на дві лінії: прокаріото/мітохондріально-еукаріотичні і архейно/цитоплазмо-еукаріотичні білки. Розбіжності між прокаріотичною і архейною гілками філогенетичного дерева Лей РС у першу чергу пов’язані зі структурою двох доменів ферменту – коректуючого і С-кінцевого. Для експресії гена ЛейРСТТ у клітинах E. coli відповідний ген клоновано в експресуючий вектор pET29b. Висновки. Клонований ген leuS T. thermophilus і рекомбінантний білок, який експресується, будуть використані для структурно-функціональних досліджень ЛейРСТТ, включаючи рентгеноструктурний аналіз ферменту і його мутантних форм у комплексі з різними субстратами.
Keywords: аміноацил-тРНК синтетази, лейцил-тРНК синтетаза Thermus thermophilus, філогенетичне дерево
Повний текст: (PDF, російською)

References

[1] Eriani G., Delarue M., Poch O., Gangloff J., Moras D. Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs Nature 1990 347, N 6289 P. 203–206.
[2] Cusack S., Berthet-Colominas C., Hartlein M., Nassar N., Leberman R. A second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5 C Nature 1990 347, N 6290 P. 249–255.
[3] Cusack S., Yaremchuk A., Tukalo M. The 2 C crystal structure of leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-adenylate analogue EMBO J 2000 19, N 10 P. 2351–2361.
[4] Nureki O., Vassylyev D. G., Tateno M., Shimada A., Nakama T., Fukai S., Konno M., Hendrickson T. L., Schimmel P., Yokoyama S. Enzyme structure with two catalytic sites for double-sieve selection of substrate Science 1998 280, N 5363 P. 578–582.
[5] Biou V., Yaremchuk A., Tukalo M., Cusack S. The 2.9 C crystal structure of T. thermophilus seryl-tRNA synthetase complexed with tRNA(Ser) Science 1994 263, N 5152 P. 1404–1410.
[6] Yaremchuk A., Kriklivyi I., Tukalo M., Cusack S. Class I tyrosyl-tRNA synthetase has a class II mode of cognate tRNA recognition EMBO J 2002 21, N 14 P. 3829–3840.
[7] Tukalo M., Yaremchuk A., Fukunaga R., Yokoyama S., Cusack S. The crystal structure of leucyl-tRNA synthetase complexed with tRNALeu in the post-transfer-editing conformation Nat. Struct. Mol. Biol 2005 12, N 10 P. 923–930.
[8] Asahara H., Himeno H., Tamura K., Hasegawa T., Watanabe K., Shimizu M. Recognition nucleotides of Escherichia coli tRNALeu and its elements facilitating discrimination from tRNASer and tRNATyr J. Mol. Biol 1993 231, N 2 P. 219–229.
[9] Yaremchuk A., Cusack S., Gudzera O., Grotli M., Tukalo M. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of Thermus thermophilus leucyl-tRNA synthetase and its complexes with leucine and a non-hydrolysable leucyl-adenylate analogue Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr 2000 56, Pt 5 P. 667–669.
[10] Marmur J. A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms J. Mol. Biol 1961 3, N 2 P. 208–218.
[11] Yaremchuk A. D., Gudzera O. I., Egorova S. P., Rozhko D. I., Kriklivy I. A., Tukalo M. A. Leucyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus. Purification and some properties of the crystallizing enzyme Biopolym. Cell 2001 17, N 3 P. 216–220.
[12] Gudzera O. I., Yaremchuk A. D., Tukalo M. A. Functional role of C-terminal domain of Thermus thermophilus leucyl-tRNA synthetase Biopolym. Cell 2010 26, N 6 P. 478–485.
[13] Hsu J. L., Rho S. B., Vannella K. M., Martinis S. A. Functional divergence of a unique C-terminal domain of leucyl-tRNA synthetase to accommodate its splicing and aminoacylation roles J. Biol. Chem 2006 281, N 32 P. 23075–23082.
[14] Fukunaga R., Yokoyama S. The C-terminal domain of the archaeal leucyl-tRNA synthetase prevents misediting of isoleucyltRNA(Ile) Biochemistry 2007 46, N 17 P. 4985–4996.
[15] Fukunaga R., Yokoyama S. Crystal structure of leucyl-tRNA synthetase from the archaeon Pyrococcus horikoshii reveals a novel editing domain orientation J. Mol. Biol 2005 346, N 1 P. 57–71.
[16] Lincecum T. L. Jr., Tukalo M., Yaremchuk A., Mursinna R. S., Williams A. M., Sproat B. S., Van Den Eynde W., Link A., Van Calenbergh S., Grotli M., Martinis S. A., Cusack S. Structural and mechanistic basis of preand posttransfer editing by leucyltRNA synthetase Mol. Cell 2003 11, N 4 P. 951–963.
[17] Rock F. L., Mao W., Yaremchuk A., Tukalo M., Crepin T., Zhou H., Zhang Y. K., Hernandez V., Akama T., Baker S. J., Plattner J. J., Shapiro L., Martinis S. A., Benkovic S. J., Cusack S., Alley M. R. An antifungal agent inhibits an aminoacyl-tRNA synthetase by trapping tRNA in the editing site Science 2007 316, N 5832 P. 1759–1761.