Biopolym. Cell. 2025; 41(3):200.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000B20
Молекулярна та клітинна біотехнології
Порівняльний аналіз методів очищення суспензій позаклітинних везикул з культури мезенхімальних стовбурових клітин людини
1, 2Хмельницька Ю. М., 1Пихтєєв Д. М., 1Юр’єв Б. В., 1Свобода М. Ф., 1Гуменюк М. І.
  1. Лабораторія біотехнології Банку пуповинної крові, тканин та інших клітин людини БО "Reocell"
    Вул. Амосова, 10, Київ, Україна 03141
  2. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143

Abstract

Мета. Оцінити вплив методів ізоляції та умов культивування на чистоту, вихід і фенотип позаклітинних везикул (ПВ), отриманих з мезенхімальних стромальних клітин людини. Методи. ПВ ізолювали методом тангенціальної фільтрації (ТФ) із мембранами молекулярно-масового порогу 100–300 kDa у поєднанні з ультрацентрифугуванням (УЦФ), за умов з додаванням сироватки та без неї. Концентрацію частинок і розподіл за розмірами (40–1000 нм) визначали методом проточної цитометрії, вміст білка — флуорометрично. Морфологію оцінювали за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії, а експресію маркерів CD9, CD63 і CD81 — методом імунофенотипування. Результати. Сироваткові середовища сприяли вищому виходу ПВ, але супроводжувались значним білковим забрудненням. Найчистіші ізоляти (0,09–0,2 мг/мл білка) отримано у безсироваткових умовах із застосуванням ТФ <100 kDa та УЦФ. За цих умов переважали CD63⁺ екзосоми (до 98%). Електронна мікроскопія підтвердила характерну морфологію ПВ діаметром 30–200 нм. Висновки. Поєднання ТФ та УЦФ дозволяє регулювати чистоту та вихід ПВ. Безсироваткові умови культивування значно покращують біохімічну чистоту та фенотипову специфічність ізолятів, що робить їх більш придатними для подальших досліджень. Оптимізація параметрів фільтрації залишається ключовою для досягнення балансу між концентрацією та якістю ПВ.
Keywords: позаклітинні везикули, мезенхімальні стовбурові клітини, безсироваткове культивування, фільтрація тангенціальним потоком, характеристика позаклітинних везикул, чистота позаклітинних везикул
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Xie F, Zhou X, Fang M, Li H, Su P, Tu Y, Zhang L, Zhou F. Extracellular vesicles in cancer immune microenvironment and cancer immunotherapy. Adv Sci (Weinh). 2019; 6(24):1901779.
[2] Liu YJ, Wang C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 2023; 21(1):77.
[3] Wang J, Chen P, Xie H, Liu BF. Extracellular vesicle engineering for clinical therapy. Singapore: Springer Nature Singapore; 2024; p. 513-25.
[4] Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; 30(1).
[5] Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, Bora A, Lässer C, Lötvall J, Nolte-'t Hoen EN, Piper MG, Sivaraman S, Skog J, Théry C, Wauben MH, Hochberg F. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2013; 2(1):20360.
[6] Li P, Kaslan M, Lee SH, Yao J, Gao Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 2017; 7(3):789-804.
[7] Böing AN, van der Pol E, Grootemaat AE, Coumans FA, Sturk A, Nieuwland R. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 2014; 3(1):23430.
[8] Baranyai T, Herczeg K, Onódi Z, Voszka I, Módos K, Marton N, Nagy G, Mäger I, Wood MJ, El Andaloussi S, Pálinkás Z, Kumar V, Nagy P, Kittel Á, Buzás EI, Ferdinandy P, Giricz Z. Isolation of exosomes from blood plasma: qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 2015; 10(12):e0145686.
[9] Lötvall J, Hill AF, Hochberg F, Buzás EI, Di Vizio D, Gardiner C, Gho YS, Kurochkin IV, Mathivanan S, Quesenberry P, Sahoo S, Tahara H, Wauben MH, Witwer KW, Théry C. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 2014; 3(1):26913.
[10] Chen W, Li H, Su W, Qin J. Microfluidic device for on-chip isolation and detection of circulating exosomes in blood of breast cancer patients. Biomicrofluidics. 2019; 13(5):054113.
[11] He M, Zeng Y. Microfluidic exosome analysis toward liquid biopsy for cancer. J Lab Autom. 2016; 21(4):599-608.
[12] Zhang Y, Liu Y, Liu H, Tang WH. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell Biosci. 2019; 9(1):19.
[13] Mukerjee N, Bhattacharya A, Maitra S, Kaur M, Ganesan S, Mishra S, Ashraf A, Rizwan M, Kesari KK, Tabish TA, Thorat ND. Exosome isolation and characterization for advanced diagnostic and therapeutic applications. Mater Today Bio. 2025; 31:101613.
[14] Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, Bora A, Lässer C, Lötvall J, Nolte-'t Hoen EN, Piper MG, Sivaraman S, Skog J, Théry C, Wauben MH, Hochberg F. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2013; 2(1):20360.
[15] Kowal J, Tkach M, Théry C. Biogenesis and secretion of exosomes. Curr Opin Cell Biol. 2014; 29:116-25.
[16] Hessvik NP, Llorente A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 2018; 75(2):193-208.
[17] Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 2013; 200(4):373-83.
[18] van der Pol E, Böing AN, Harrison P, Sturk A, Nieuwland R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacol Rev. 2012; 64(3):676-705.
[19] Li P, Kaslan M, Lee SH, Yao J, Gao Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 2017; 7(3):789-804.
[20] Li J, Lee Y, Johansson HJ, Mäger I, Vader P, Nordin JZ, Wiklander OP, Lehtiö J, Wood MJ, Andaloussi SE. Serum-free culture alters the quantity and protein composition of neuroblastoma-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2015; 4(1):26883.
[21] Visan KS, Lobb RJ, Ham S, Lima LG, Palma C, Edna CPZ, Wu LY, Gowda H, Datta KK, Hartel G, Salomon C, Möller A. Comparative analysis of tangential flow filtration and ultracentrifugation, both combined with subsequent size exclusion chromatography, for the isolation of small extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2022; 11(9):e12266.
[22] Nordin JZ, Lee Y, Vader P, Mäger I, Johansson HJ, Heusermann W, Wiklander OP, Hällbrink M, Seow Y, Bultema JJ, Gilthorpe J, Davies T, Fairchild PJ, Gabrielsson S, Meisner-Kober NC, Lehtiö J, Smith CI, Wood MJ, El Andaloussi S. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine. 2015; 11(4):879-83.
[23] Yáñez-Mó M, Siljander PR, Andreu Z, Zavec AB, Borràs FE, Buzas EI, Buzas K, Casal E, Cappello F, Carvalho J, Colás E, Cordeiro-da Silva A, Fais S, Falcon-Perez JM, Ghobrial IM, Giebel B, Gimona M, Graner M, Gursel I, Gursel M, Heegaard NH, Hendrix A, Kierulf P, Kokubun K, Kosanovic M, Kralj-Iglic V, Krämer-Albers EM, Laitinen S, Lässer C, Lener T, Ligeti E, Linē A, Lipps G, Llorente A, Lötvall J, Manček-Keber M, Marcilla A, Mittelbrunn M, Nazarenko I, Nolte-'t Hoen EN, Nyman TA, O'Driscoll L, Olivan M, Oliveira C, Pállinger É, Del Portillo HA, Reventós J, Rigau M, Rohde E, Sammar M, Sánchez-Madrid F, Santarém N, Schallmoser K, Ostenfeld MS, Stoorvogel W, Stukelj R, Van der Grein SG, Vasconcelos MH, Wauben MH, De Wever O. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 2015; 4(1):27066.
[24] Théry C, Witwer KW, Aikawa E, Alcaraz MJ, Anderson JD, Andriantsitohaina R, Antoniou A, Arab T, Archer F, Atkin-Smith GK, Ayre DC, Bach JM, Bachurski D, Baharvand H, Balaj L, Baldacchino S, Bauer NN, Baxter AA, Bebawy M, Beckham C, Bedina Zavec A, Benmoussa A, Berardi AC, Bergese P, Bielska E, Blenkiron C, Bobis-Wozowicz S, Boilard E, Boireau W, Bongiovanni A, Borràs FE, Bosch S, Boulanger CM, Breakefield X, Breglio AM, Brennan MÁ, Brigstock DR, Brisson A, Broekman ML, Bromberg JF, Bryl-Górecka P, Buch S, Buck AH, Burger D, Busatto S, Buschmann D, Bussolati B, Buzás EI, Byrd JB, Camussi G, Carter DR, Caruso S, Chamley LW, Chang YT, Chen C, Chen S, Cheng L, Chin AR, Clayton A, Clerici SP, Cocks A, Cocucci E, Coffey RJ, Cordeiro-da-Silva A, Couch Y, Coumans FA, Coyle B, Crescitelli R, Criado MF, D'Souza-Schorey C, Das S, Datta Chaudhuri A, de Candia P, De Santana EF, De Wever O, Del Portillo HA, Demaret T, Deville S, Devitt A, Dhondt B, Di Vizio D, Dieterich LC, Dolo V, Dominguez Rubio AP, Dominici M, Dourado MR, Driedonks TA, Duarte FV, Duncan HM, Eichenberger RM, Ekström K, El Andaloussi S, Elie-Caille C, Erdbrügger U, Falcón-Pérez JM, Fatima F, Fish JE, Flores-Bellver M, Försönits A, Frelet-Barrand A, Fricke F, Fuhrmann G, Gabrielsson S, Gámez-Valero A, Gardiner C, Gärtner K, Gaudin R, Gho YS, Giebel B, Gilbert C, Gimona M, Giusti I, Goberdhan DC, Görgens A, Gorski SM, Greening DW, Gross JC, Gualerzi A, Gupta GN, Gustafson D, Handberg A, Haraszti RA, Harrison P, Hegyesi H, Hendrix A, Hill AF, Hochberg FH, Hoffmann KF, Holder B, Holthofer H, Hosseinkhani B, Hu G, Huang Y, Huber V, Hunt S, Ibrahim AG, Ikezu T, Inal JM, Isin M, Ivanova A, Jackson HK, Jacobsen S, Jay SM, Jayachandran M, Jenster G, Jiang L, Johnson SM, Jones JC, Jong A, Jovanovic-Talisman T, Jung S, Kalluri R, Kano SI, Kaur S, Kawamura Y, Keller ET, Khamari D, Khomyakova E, Khvorova A, Kierulf P, Kim KP, Kislinger T, Klingeborn M, Klinke DJ 2nd, Kornek M, Kosanović MM, Kovács ÁF, Krämer-Albers EM, Krasemann S, Krause M, Kurochkin IV, Kusuma GD, Kuypers S, Laitinen S, Langevin SM, Languino LR, Lannigan J, Lässer C, Laurent LC, Lavieu G, Lázaro-Ibáñez E, Le Lay S, Lee MS, Lee YXF, Lemos DS, Lenassi M, Leszczynska A, Li IT, Liao K, Libregts SF, Ligeti E, Lim R, Lim SK, Linē A, Linnemannstöns K, Llorente A, Lombard CA, Lorenowicz MJ, Lörincz ÁM, Lötvall J, Lovett J, Lowry MC, Loyer X, Lu Q, Lukomska B, Lunavat TR, Maas SL, Malhi H, Marcilla A, Mariani J, Mariscal J, Martens-Uzunova ES, Martin-Jaular L, Martinez MC, Martins VR, Mathieu M, Mathivanan S, Maugeri M, McGinnis LK, McVey MJ, Meckes DG Jr, Meehan KL, Mertens I, Minciacchi VR, Möller A, Møller Jørgensen M, Morales-Kastresana A, Morhayim J, Mullier F, Muraca M, Musante L, Mussack V, Muth DC, Myburgh KH, Najrana T, Nawaz M, Nazarenko I, Nejsum P, Neri C, Neri T, Nieuwland R, Nimrichter L, Nolan JP, Nolte-'t Hoen EN, Noren Hooten N, O'Driscoll L, O'Grady T, O'Loghlen A, Ochiya T, Olivier M, Ortiz A, Ortiz LA, Osteikoetxea X, Østergaard O, Ostrowski M, Park J, Pegtel DM, Peinado H, Perut F, Pfaffl MW, Phinney DG, Pieters BC, Pink RC, Pisetsky DS, Pogge von Strandmann E, Polakovicova I, Poon IK, Powell BH, Prada I, Pulliam L, Quesenberry P, Radeghieri A, Raffai RL, Raimondo S, Rak J, Ramirez MI, Raposo G, Rayyan MS, Regev-Rudzki N, Ricklefs FL, Robbins PD, Roberts DD, Rodrigues SC, Rohde E, Rome S, Rouschop KM, Rughetti A, Russell AE, Saá P, Sahoo S, Salas-Huenuleo E, Sánchez C, Saugstad JA, Saul MJ, Schiffelers RM, Schneider R, Schøyen TH, Scott A, Shahaj E, Sharma S, Shatnyeva O, Shekari F, Shelke GV, Shetty AK, Shiba K, Siljander PR, Silva AM, Skowronek A, Snyder OL 2nd, Soares RP, Sódar BW, Soekmadji C, Sotillo J, Stahl PD, Stoorvogel W, Stott SL, Strasser EF, Swift S, Tahara H, Tewari M, Timms K, Tiwari S, Tixeira R, Tkach M, Toh WS, Tomasini R, Torrecilhas AC, Tosar JP, Toxavidis V, Urbanelli L, Vader P, van Balkom BW, van der Grein SG, Van Deun J, van Herwijnen MJ, Van Keuren-Jensen K, van Niel G, van Royen ME, van Wijnen AJ, Vasconcelos MH, Vechetti IJ Jr, Veit TD, Vella LJ, Velot É, Verweij FJ, Vestad B, Viñas JL, Visnovitz T, Vukman KV, Wahlgren J, Watson DC, Wauben MH, Weaver A, Webber JP, Weber V, Wehman AM, Weiss DJ, Welsh JA, Wendt S, Wheelock AM, Wiener Z, Witte L, Wolfram J, Xagorari A, Xander P, Xu J, Yan X, Yáñez-Mó M, Yin H, Yuana Y, Zappulli V, Zarubova J, Žėkas V, Zhang JY, Zhao Z, Zheng L, Zheutlin AR, Zickler AM, Zimmermann P, Zivkovic AM, Zocco D, Zuba-Surma EK. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018; 7(1):1535750.
[25] Kowal J, Arras G, Colombo M, Jouve M, Morath JP, Primdal-Bengtson B, Dingli F, Loew D, Tkach M, Théry C. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016; 113(8):E968-77.
[26] Wang T, Zhang H. Exploring the roles and molecular mechanisms of RNA binding proteins in the sorting of noncoding RNAs into exosomes during tumor progression. J Adv Res. 2024; 65:105-23.
[27] van Niel G, D'Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018; 19(4):213-28.
[28] Gurung S, Perocheau D, Touramanidou L, Baruteau J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Commun Signal. 2021; 19(1):47.
[29] Colombo M, Raposo G, Théry C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014; 30(1):255-89.