Biopolym. Cell. 2022; 38(1):9-16.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000A6D
Структура та функції біополімерів
Власна флуоресценція однотриптофанової форми каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази із замінами Trp 87 та Trp 283 на аланін
1Блащак І. О., 1Заєць В. Н., 1Коломієць Л. А., 1Корнелюк А. І.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143

Abstract

Мета. Тирозил-тРНК-синтетаза ссавців (TyrRS) складається з N-кінцевого каталітичного модуля miniTyrRS та некаталітичного С-кінцевого домену. Після розщеплення обидва домени TyrRS виявляють неканонічні цитокінові функції. Важливо вивчити конформаційні зміни miniTyrRS як у процесі розпізнавання субстратів, особливо тРНК, так і інших лігандів у різних нанокомпозитних комплексах. Флуоресцентна спектроскопія — дуже потужний метод виявлення локальних конформаційних змін ферментів. Вивчення однотриптофанової форми білка може надати важливу інформацію про локальну гнучкість та конформаційні зміни активного центру ферменту. Методи. Сайт-спрямований мутагенез, бактеріальна експресія, флуоресцентна спектроскопія. Результати. Характеристики власної флуоресценції однотриптофанової форми Trp-40 miniTyrRS були виміряні та виявили спектральний максимум при 332 нм, що відповідає екранованому стану флуорофору Trp40. Гасіння флуоресценції Trp-40 акриламідом показало наявність конформаційної рухливості активного центру. Висновки. Флуоресцентні дослідження однотриптофанової форми тирозил-тРНК синтетази виявили екранований стан флуорофору Trp40, але високу конформаційну рухливість активного центру ферменту в часовому наносекундному інтервалі.
Keywords: тирозил-тРНК синтетаза, флуоресцентна спектроскопія, мутантна форма miniTyrRS, активний центр, конформаційна рухливість
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Mirande M. Aminoacyl-tRNA synthetase family from prokaryotes and eukaryotes: structural domains and their implications. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1991;40:95-142.
[2] Pang YL, Poruri K, Martinis SA. tRNA synthetase: tRNA aminoacylation and beyond. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2014;5(4):461-80.
[3] Kornelyuk AI. Structural and functional investigation of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase. Biopolym Cell. 1998; 14(4):349-59.
[4] Korneliuk AI, Kurochkin IV, Matsuka GKh. Tirozil-tRNK-sintetaza iz pecheni byka. Vydelenie i fiziko-khimicheskie svoĭstva. Mol Biol (Mosk). 1988;22(1):176-86.
[5] Gnatenko DV, Korneliuk AI, Kurochkin IV, Ribkinska TA, Matsuka GKh. Vydelenie i kharkteristkia funktsional'no aktivnoĭ proteoliticheski modifitsirovannoĭ formy tirozil-tRNK-sintetazy iz pecheni byka. Ukr Biokhim Zh (1978). 1991;63(4):61-7.
[6] Wakasugi K, Schimmel P. Highly differentiated motifs responsible for two cytokine activities of a split human tRNA synthetase. J Biol Chem. 1999;274(33):23155-9.
[7] Kornelyuk AI, Tas MPR, Dubrovsky AL, Murray CJ. Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetasee. Biopolym Cell. 1999; 15(2):168-172.
[8] Guo M, Schimmel P. Essential nontranslational functions of tRNA synthetases. Nat Chem Biol. 2013;9(3):145-53.
[9] Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy 3nd ed. Manuscript. Springer New York, NY, 2006; 954 p.
[10] Ladokhin AS. Fluorescence spectroscopy. In Peptide and protein. Chichester, England. John Wiley & Sons Ltd, 2000; 5762-79.
[11] Demchenko AP. Fluorescence and Dynamics in Proteins. In: Eds Lakowicz JR. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 2002; 65-111.
[12] Burstein EA, Vedenkina NS, Ivkova MN. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochem Photobiol. 1973;18(4):263-79.
[13] Chen Y, Barkley MD. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 1998;37(28):9976-82.
[14] Korneliuk AI, Matsuka GKh, Shilin VV. Fluorestsentnyĭ analiz dostupnosti triptofanovykh ostatkov leĭtsil-tRNK-sintetazy v ferment-substratnykh kompleksakh. Biofizika. 1980;25(3):402-4.
[15] Klimenko IV, Guscha TO, Kornelyuk AI. Properties of tryptophan fluorescence of two forms of tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver. Biopolym Cell. 1991;7(6):83-8.
[16] Kornelyuk AI, Klimenko IV, Odynets KA. Conformational change of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase induced by tyrosyl adenylate formation. Biochem Mol Biol Int. 1995;35(2):317-22.
[17] Zayets VN, Tsuvarev AYu, Kolomiiets LA, Korneliuk AI. Site-directed mutagenesis of tryptophan residues in the structure of the catalytic module of tyrosyl-tRNA synthetase from Bos taurus. Cytol Genet. 2019; 53(3): 47-57.
[18] Sambrook J, Fritsch T, Manniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2th ed. New York: "Cold Spring Harbor Laboratory Press", 1989.
[19] Nishimura A, Morita M, Nishimura Y, Sugino Y. A rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells. Nucleic Acids Res. 1990;18(20):6169.
[20] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5.
[21] Kordysh MA, Odynets KA, Kornelyuk AI. Trp144 as a fluorescence probe for investigation of the C-module rapid conformation dynamics in eukaryotic tyrosyle-tRNA synthetase. Biopolym Cell. 2003;19(5):436-9.
[22] Kordysh M, Kornelyuk A. Conformational flexibility of cytokine-like C-module of tyrosyl-tRNA synthetase monitored by Trp144 intrinsic fluorescence. J Fluoresc. 2006;16(5):705-11.
[23] Vivian JT, Callis PR. Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins. Biophys J. 2001;80(5):2093-109.
[24] Royer CA. Probing protein folding and conformational transitions with fluorescence. Chem Rev. 2006;106(5):1769-84.
[25] Engelborghs Y. Correlating protein structure and protein fluorescence. J Fluoresc. 2003; 13: 9-16.
[26] Gallay J, Vincent M, Li de la Sierra IM, Alvarez J, Ubieta R, Madrazo J, Padron G. Protein flexibility and aggregation state of human epidermal growth factor. A time-resolved fluorescence study of the native protein and engineered single-tryptophan mutants. Eur J Biochem. 1993;211(1-2):213-9.
[27] Weitzman C, Consler TG, Kaback HR. Fluorescence of native single-Trp mutants in the lactose permease from Escherichia coli: structural properties and evidence for a substrate-induced conformational change. Protein Sci. 1995;4(11):2310-8.
[28] Kozachkov L, Padan E. Site-directed tryptophan fluorescence reveals two essential conformational changes in the Na+/H+ antiporter NhaA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(38):15769-74.
[29] Raghuraman H, Chatterjee S, Das A. Site-Directed Fluorescence Approaches for Dynamic Structural Biology of Membrane Peptides and Proteins. Front Mol Biosci. 2019;6:96.