Biopolym. Cell. 2019; 35(2):91-98.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.00099A
Структура та функції біополімерів
Оптимізація протоколу збірки нуклеосом з використанням гістонів і модельних ДНК-дуплексів і оцінка ефективності процесу реконструкції
1, 2Кутузов М. М., 1, 2Кургіна Т. А., 1, 2Белоусова Є. А., 1Ходирева С. Н., 1, 2Лаврік О. І.
  1. Інститут хімичної біології і фундаментальної медицини СО РАН
    пр. ак. Лаврентьєва, 8, Новосибірськ, Російська Федерація, 630090
  2. Новосибірський державний університет
    вул. Пирогова, 2, Новосибірськ, Російська Федерація, 630090

Abstract

Нуклеосомна корова частка, НКЧ, являє собою зручну модельну систему для вивчення ключових ДНК-залежних процесів, оскільки є елементарною одиницею структури хроматину. Саме тому основним завданням представленого дослідження було створення універсального методу збірки нуклеосом. Для реконструкції НКЧ використовуються очищені гістони і ДНК-структури з певними послідовностями, що забезпечують чітке позиціонування ДНК відносно октамера гістонів. Це вимагає наявності способу контролю ефективності реконструкції НКЧ. Мета. Оптимізувати процедуру реконструкції НКЧ з очищених октамер гістонів і різних типів синтезованих модельних ДНК і запропонувати підхід для експрес-аналізу ефективності цього процесу. Методи. Діаліз, поділ в ПААГ, вимір флуоресценції з використанням барвника Eva-Green. Результати. Ми розробили зручну процедуру складання НКЧ в слабо сольовому буфері із змінним співвідношенням ДНК-гістони на першому етапі. Після визначення оптимального співвідношення реконструкція НКЧ може бути проведена за допомогою повільного градиентного діалізу. На цьому етапі ефективність процесу може бути оцінена безпосередньо в розчині з використанням барвника Eva-Green. Висновки. Було показано, що ефективність интеркаляции барвника в дуплекс ДНК в контексті нуклеосоми різко знижується. До основних переваг запропонованого підходу можна віднести швидкий аналіз суміші безпосередньо в розчині і можливість використання ДНК, що не містять будь-яких спеціальних міток.
Keywords: збірка нуклеосомних корових частинок, хроматин, корові гістони
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] MacAlpine DM, Almouzni G. Chromatin and DNA replication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(8):a010207.
[2] Balliano AJ, Hayes JJ. Base excision repair in chromatin: Insights from reconstituted systems. DNA Repair (Amst). 2015;36:77-85.
[3] Lee J, Crickard JB, Reese JC, Lee TH. Single-molecule FRET method to investigate the dynamics of transcription elongation through the nucleosome by RNA polymerase II. Methods. 2019 Jan 17. pii: S1046-2023(18)30293-7.
[4] Osterman LA. Chromatography of proteins and nucleic acids. Moscow: Nauka, 1985. 536 p.
[5] Simon RH, Felsenfeld G. A new procedure for purifying histone pairs H2A + H2B and H3 + H4 from chromatin using hydroxylapatite. Nucleic Acids Res. 1979;6(2):689-96.
[6] Schnitzler GR. Isolation of histones and nucleosome cores from mammalian cells. Curr Protoc Mol Biol. 2001;Chapter 21:Unit 21.5.
[7] Peterson CL, Hansen JC. Chicken erythrocyte histone octamer preparation. CSH Protoc. 2008;2008:pdb.prot5112.
[8] Lowary PT, Widom J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 1998;276(1):19-42.
[9] Cannan WJ, Tsang BP, Wallace SS, Pederson DS. Nucleosomes suppress the formation of double-strand DNA breaks during attempted base excision repair of clustered oxidative damages. J Biol Chem. 2014;289(29):19881-93.
[10] Hinz JM. Impact of abasic site orientation within nucleosomes on human APE1 endonuclease activity. Mutat Res. 2014;766-767:19-24.
[11] Green RM, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 4th edition. 2012: 2028
[12] Mao F, Leung WY, Xin X. Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol. 2007;7:76.