Biopolym. Cell. 2018; 34(6):435-444.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.00098E
Структура та функції біополімерів
Експресія та очистка повнорозмірної аланіл-тРНК-синтетази Thermus thermophilus штаму HB27
1Рибак М. Ю., 1Прісс А. Є., 1Гудзера О. І., 2Ковальчук А. О., 1Крикливий І. А., 1Тукало М. А.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143
  2. Навчально-науковий центр «Інститут біології та медицини»
    Київського національного університету імені Тараса Шевченка
    вул. Володимирська, 64/13, Київ, Україна, 01601

Abstract

Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК.
Keywords: аміноацил-тРНК-синтетаза, AлаРС T. thermophilus, експресія рекомбінантного білка, хроматографічне очищення білка
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Fersht AR, Kaethner MM. Mechanism of aminoacylation of tRNA. Proof of the aminoacyl adenylate pathway for the isoleucyl- and tyrosyl-tRNA synthetases from Escherichia coli K12. Biochemistry. 1976;15(4):818-23.
[2] Ibba M, Soll D. Aminoacyl-tRNA synthesis. Annu Rev Biochem. 2000;69:617-50. Review.
[3] Schimmel P. Classes of aminoacyl-tRNA synthetases and the establishment of the genetic code. Trends Biochem Sci. 1991;16(1):1-3.
[4] Eriani G, Delarue M, Poch O, Gangloff J, Moras D. Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs. Nature. 1990;347(6289):203-6.
[5] Schimmel PR, Söll D. Aminoacyl-tRNA synthetases: general features and recognition of transfer RNAs. Annu Rev Biochem. 1979;48:601-48.
[6] Naganuma M, Sekine S, Fukunaga R, Yokoyama S. Unique protein architecture of alanyl-tRNA synthetase for aminoacylation, editing, and dimerization. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(21):8489-94.
[7] Guo M, Chong YE, Beebe K, Shapiro R, Yang XL, Schimmel P. The C-Ala domain brings together editing and aminoacylation functions on one tRNA. Science. 2009;325(5941):744-7.
[8] Putney SD, Sauer RT, Schimmel PR. Purification and properties of alanine tRNA synthetase from Escherichia coli A tetramer of identical subunits. J Biol Chem. 1981;256(1):198-204.
[9] Lechler A, Martin A, Zuleeg T, Limmer S, Kreutzer R. A biologically active 53 kDa fragment of overproduced alanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus HB8 specifically interacts with tRNA Ala acceptor helix. Nucleic Acids Res. 1997;25(14):2737-44.
[10] Dignam SS, Dignam JD. Glycyl- and alanyl-tRNA synthetases from Bombyx mori. Purification and properties. J Biol Chem. 1984;259(7):4043-8.
[11] Putney SD, Meléndez DL, Schimmel PR. Cloning, partial sequencing, and in vitro transcription of the gene for alanine tRNA synthetase. J Biol Chem. 1981;256(1):205-11.
[12] Jasin M, Regan L, Schimmel P. Modular arrangement of functional domains along the sequence of an aminoacyl tRNA synthetase. Nature. 1983 Dec 1-7;306(5942):441-7.
[13] Wu MX, Filley SJ, Xiong J, Lee JJ, Hill KA. A cysteine in the C-terminal region of alanyl-tRNA synthetase is important for aminoacylation activity. Biochemistry. 1994;33(40):12260-6.
[14] Tsui WC, Fersht AR. Probing the principles of amino acid selection using the alanyl-tRNA synthetase from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 1981;9(18):4627-37.
[15] Swairjo MA, Otero FJ, Yang XL, Lovato MA, Skene RJ, McRee DE, Ribas de Pouplana L, Schimmel P. Alanyl-tRNA synthetase crystal structure and design for acceptor-stem recognition. Mol Cell. 2004;13(6):829-41.
[16] Guo M, Chong YE, Shapiro R, Beebe K, Yang XL, Schimmel P. Paradox of mistranslation of serine for alanine caused by AlaRS recognition dilemma. Nature. 2009;462(7274):808-12.
[17] Guo M, Shapiro R, Schimmel P, Yang XL. Introduction of a leucine half-zipper engenders multiple high-quality crystals of a recalcitrant tRNA synthetase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(Pt 3):243-50.
[18] Dignam JD, Guo J, Griffith WP, Garbett NC, Holloway A, Mueser T. Allosteric interaction of nucleotides and tRNA(ala) with E. coli alanyl-tRNA synthetase. Biochemistry. 2011;50(45):9886-900.
[19] Beebe K, Mock M, Merriman E, Schimmel P. Distinct domains of tRNA synthetase recognize the same base pair. Nature. 2008;451(7174):90-3.
[20] Naganuma M, Sekine S, Chong YE, Guo M, Yang XL, Gamper H, Hou YM, Schimmel P, Yokoyama S. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G•U pair. Nature. 2014;510(7506):507-11.
[21] Sun L, Gomes AC, He W, Zhou H, Wang X, Pan DW, Schimmel P, Pan T, Yang XL. Evolutionary Gain of Alanine Mischarging to Noncognate tRNAs with a G4:U69 Base Pair. J Am Chem Soc. 2016;138(39):12948-12955.
[22] Sun L, Song Y, Blocquel D, Yang XL, Schimmel P. Two crystal structures reveal design for repurposing the C-Ala domain of human AlaRS. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(50):14300-14305. PubMed Central
[23] Chong YE, Guo M, Yang XL, Kuhle B, Naganuma M, Sekine SI, Yokoyama S, Schimmel P. Distinct ways of G:U recognition by conserved tRNA binding motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115(29):7527-7532.
[24] Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. Journal Mol Biol. 1961; 3(2): 208-IN1.
[25] The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D158-D169.
[26] Benson DA, Karsch-Mizrachi I, Clark K, Lipman DJ, Ostell J, Sayers EW. GenBank. Nucleic Acids Res. 2012;40(Database issue):D48-53.
[27] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248-54.
[28] Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. The proteomics protocols handbook. Springer. 2005;-571-607.
[29] Fukunaga R, Yokoyama S. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic study of alanyl-tRNA synthetase from the archaeon Archaeoglobus fulgidus. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007;63(Pt 3):224-8.