Biopolym. Cell. 2018; 34(2):85-96.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000973
Геноміка, транскриптоміка та протеоміка
Роль рівнів експресії референсних та досліджуваних генів при раку передміхурової залози у кПЛР аналізі
1Геращенко Г. В., 2Стаховський Е. О., 1Чащина Л. І., 3Гризодуб О. П., 1Кашуба В. І.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  2. Національний інститут раку
    вул. Ломоносова, 33/43, Київ, Україна, 03022
  3. Державна установа «Інститут урології Національної академії медичних наук України»
    вул. Ю. Коцюбинського, 9-А, Київ, Україна, 04053

Abstract

Мета. Визначити профілі експресії пухлино-асоційованих генів у пухлинах передміхуровоїзалози з використанням різних протоколів нормалізації (з одно-, дво- тачотириреференсними генами АБО з одним, двома та чотирма референсними генами) таоптимізувати комбінації референсних генів для розрахунку відносної експресії (ВЕ) у ракупередміхурової залози. Методи. Кількісною ПЛР (кПЛР) проаналізовано ВЕ 23 генів у 37 зразках тканин передміхурової залози (Т) з різними показниками Глісона та різнимистадіями пухлин у порівнянні з 37 умовно-нормальними зразками тканини передміхуровоїзалози (УНТ) та 20 зразками аденом передміхурової залози. Результати. Теоретичнірозрахунки відхилення ВЕ не підтвердили впливу значень рівнів експресії на цей параметрані у ВЕ референсного гена, ані у ВЕ досліджуваних генів. Експермиментальні дані, якібули отримані, з використанням 2–ΔΔCt моделі, показали статистичні значущі відмінності у експресії 17 з 23 досліджуваних генів, при порівнянні парних T/УНТ. Показники ВЕ, розраховані з використанням моделі2–ΔCt, показали високий рівень співпадіннястатистичних даних у всіх групах референтних генів для груп аденокарциноми-УНТ-аденоми (понад 82 %). Слід зазначити, у 69% випадків, а за показниками Глісона – у 64,5 %. Висновки. Всі три типи референсних генів, як і було передбачено, можуть бутивикористані для нормалізації ВЕ у зразках пухлини передміхурової залози. Використаннямоделей 2–ΔCt або 2–ΔΔCt не має впливу на рівень ВЕ для референсних генів. Найважливішимфактором була їх стабільна експресія. Важливими параметрами для вибору порогувідмінностей рівнів експресії між групами з метою правильної інтерпретації даних є рівніекспресії досліджуваних генів, величина зміни значень ВЕ, розмір вибірки та високагетерогенність експресії.
Keywords: пухлини передміхурової залози, відносна експресія генів, перевірка референсних генів, різні рівні експресії, низько експресовані гени.
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Sanders R, Mason DJ, Foy CA, Huggett JF. Considerations for accurate gene expression measurement by reverse transcription quantitative PCR when analysing clinical samples. Anal Bioanal Chem. 2014;406(26):6471-3.
[2] Chen J, Zhao Z, Chen Y, Zhang J, Yan L, Zheng X, Liao M, Cao W. Development and application of a SYBR green real-time PCR for detection of the emerging avian leukosis virus subgroup K. Poult Sci. 2018;97(7):2568-2574.
[3] Shi W, Wang Y, Ren X, Gao S, Hua X, Guo M, Tang L, Xu Y, Ren T, Li Y, Liu M. EvaGreen-based real-time PCR assay for sensitive detection of salmonid alphavirus. Mol Cell Probes. 2018;39:7-13.
[4] Sharan RN, Vaiphei ST, Nongrum S, Keppen J, Ksoo M. Consensus reference gene(s) for gene expression studies in human cancers: end of the tunnel visible? Cell Oncol (Dordr). 2015;38(6):419-31.
[5] Dundas J, Ling M. Reference genes for measuring mRNA expression. Theory Biosci. 2012;131(4):215-23.
[6] Ohl F, Jung M, Xu C, Stephan C, Rabien A, Burkhardt M, Nitsche A, Kristiansen G, Loening SA, Radonić A, Jung K. Gene expression studies in prostate cancer tissue: which reference gene should be selected for normalization? J Mol Med (Berl). 2005;83(12):1014-24.
[7] Souza AF, Brum IS, Neto BS, Berger M, Branchini G. Reference gene for primary culture of prostate cancer cells. Mol Biol Rep. 2013;40(4):2955-62.
[8] Zhao H, Ma TF, Lin J, Liu LL, Sun WJ, Guo LX, Wang SQ, Otecko NO, Zhang YP. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Sci Rep. 2018;8(1):1949.
[9] Tsaur I, Renninger M, Hennenlotter J, Oppermann E, Munz M, Kuehs U, Stenzl A, Schilling D. Reliable housekeeping gene combination for quantitative PCR of lymph nodes in patients with prostate cancer. Anticancer Res. 2013;33(12):5243-8.
[10] Gerashchenko GV, Mankovska OS, Dmitriev AA, Mevs LV, Rosenberg EE, Pikul MV, Marynychenko MV, Gryzodub OP, Stakhovsky EO, Kashuba VI. Epithelial-mesenchymal transition related gene expression in prostate tumours. Biopolym Cell. 2017; 33(5): 335–55.
[11] Mevs LV, Gerashchenko GV, Rosenberg EE, Pikul MV, Marynychenko MV, Gryzodub OP, Vozianov SO, Stak-hovsky EO, Kashuba VI. Detection of prostate specific ETS fusion transcripts in cancer samples. Biopolym Cell. 2017; 33(4): 256–67.
[12] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-8.
[13] Schmidt U, Fuessel S, Koch R, Baretton GB, Lohse A, Tomasetti S, Unversucht S, Froehner M, Wirth MP, Meye A. Quantitative multi-gene expression profiling of primary prostate cancer. Prostate. 2006;66(14):1521-34.
[14] Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc. 1995, 57(1): 289–300.
[15] Opel KL, Chung D, McCord BR. A study of PCR inhibition mechanisms using real time PCR. J Forensic Sci. 2010;55(1):25-33.
[16] Pionzio AM, McCord BR. The effect of internal control sequence and length on the response to PCR inhibition in real-time PCR quantitation. Forensic Sci Int Genet. 2014;9:55-60.
[17] Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 2012;113(5):1014-26.
[18] Cancer Genome Atlas Research Network. The Molecular Taxonomy of Primary Prostate Cancer. Cell. 2015;163(4):1011-25.
[19] Carlisle AJ, Prabhu VV, Elkahloun A, Hudson J, Trent JM, Linehan WM, Williams ED, Emmert-Buck MR, Liotta LA, Munson PJ, Krizman DB. Development of a prostate cDNA microarray and statistical gene expression analysis package. Mol Carcinog. 2000;28(1):12-22.