Biopolym. Cell. 2015; 31(3):179-186.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.0008DE
Структура та функції біополімерів
Клонування, експресія та очистка D-Тир-тРНКТир-деацилази Thermus thermophilus
1Рибак М. Ю., 1Коваленко О. П., 1Крикливий І. А., 1Тукало М. А.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680

Abstract

D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) є консервативним білком, знайденим у всіх царствах живої природи, що забезпечує додатковий корегувальний етап гідролізу помилково аміноацильованих субстратів D-Тир-тРНКТир DTD здатна приcкорювати гідроліз ефірного зв’язку в комплексі D-Тир-тРНКТир, утворюючи вільну тРНК та D-Тир, таким чином попереджуючи включення D-амінокислот до білків. Деацилаза розрізняє D- та L-аміноацильні залишки в аміноацильованій тРНК та не гідролізує останні. Структурні основи такої специфічності та механізм гідролізу D-аміноацил-тРНК за участі DTD є недостатньо зрозумілими. Мета. Клонувати D-Тир-тРНКТир-деацилазу з T. the­rmophilus (DTDTT), оптимізувати умов її експресії в E. coli, розробити ефективний метод очищення з високим виходом високоякісного ферменту, для структурних та функціональних досліджень. Методи. Ампліфікацію та клонування в pProEXHTb DTD гена геномної ДНК T. ther­mo­philus проведено за стандартними молекулярно-біологічними методами. Очистку рекомбінантного DTD білка проводено хроматографічно. Залишки гістидину відщеплено від DTD протеазою вірусу тютюну (TEV), ефективність реакції перевірено Вестерн-блот аналізом з анти-His-антитілами. Молекулярну масу очищеної DTDTT визначено гель-фільтрацією. Результати. Отримана конструкція pProEXHTb, що містить DTD послідовність з T. thermophilus, експресовано в E.coli штаму BL21(DE3)pLysS. Цільовий рекомбінантний білок виділено і очищено комбінацєю хроматографій: афінної (Ni-NTA), аніон-обмінної (Q-Sepharose) та гель-фільтрації (Superdex S 200) до чистоти 90%. Вихід рекомбінантної DTD склав 2 мг з одного літру культури. Визначена молекулярна маса очищеної DTD з T. thermophilus – 32 кДа свідчить на користь її димерної структури. Висновки. Отриманий вектор pProEXHTb, що містить DTD з T. thermophilus і підібрані умови очистки дозволяють отримати рекомбінантний DTD в кількостях достатніх для подальших структурно-функціональних досліджень.
Keywords: D-амінокислоти, D-Тир-тРНКТир-деа­ци­лаза Thermus thermophilus, клонування, експресія, очистка.
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Corrigan JJ. D-amino acids in animals. Science. 1969;164(3876):142-9.
[2] Leiman SA, May JM, Lebar MD, Kahne D, Kolter R, Losick R. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 2013;195(23):5391-5.
[3] Fujii N. D-amino acid in elderly tissues. Biol Pharm Bull. 2005;28(9):1585-9.
[4] Liu W, Liu C, Zhu JX, Li AH, Zhao ZQ, Yin B, Peng XZ. D-Tyr-tRNA(Tyr) deacylase, a new role in Alzheimer's-associated disease in SAMP8 mice. Chin Med Sci J. 2010;25(2):90-4.
[5] Friedman M, Gumbmann MR. The nutritive value and safety of D-phenylalanine and D-tyrosine in mice. J Nutr. 1984;114(11):2089-96.
[6] Friedman M. Formation, nutritional value, and safety of D-amino acids. Adv Exp Med Biol. 1991;289:447-81.
[7] Friedman M. Chemistry, nutrition, and microbiology of D-amino acids. J Agric Food Chem. 1999;47(9):3457-79.
[8] Friedman M. Origin, microbiology, nutrition, and pharmaco­lo­gy of D-amino acids. Chem Biodivers. 2010;7(6):1491–530.
[9] Calendar R, Berg P. D-Tyrosyl RNA: formation, hydrolysis and utilization for protein synthesis. J Mol Biol. 1967;26(1):39-54.
[10] Soutourina J, Plateau P, Blanquet S. Metabolism of D-aminoacyl-tRNAs in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae cells. J Biol Chem. 2000;275(42):32535-42.
[11] Wydau S, van der Rest G, Aubard C, Plateau P, Blanquet S. Widespread distribution of cell defense against D-aminoacyl-tRNAs. J Biol Chem. 2009;284(21):14096-104.
[12] Soutourina J, Plateau P, Delort F, Peirotes A, Blanquet S. Functional characterization of the D-Tyr-tRNATyr deacylase from Escherichia coli. J Biol Chem. 1999;274(27):19109-14.
[13] Soutourina J, Blanquet S, Plateau P. D-tyrosyl-tRNA(Tyr) metabolism in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 2000;275(16):11626-30.
[14] Wydau S, Ferri-Fioni ML, Blanquet S, Plateau P. GEK1, a gene product of Arabidopsis thaliana involved in ethanol tolerance, is a D-aminoacyl-tRNA deacylase. Nucleic Acids Res. 2007;35(3):930-8.
[15] Zheng G, Liu W, Gong Y, Yang H, Yin B, Zhu J, Xie Y, Peng X, Qiang B, Yuan J. Human D-Tyr-tRNA(Tyr) deacylase contributes to the resistance of the cell to D-amino acids. Biochem J. 2009;417(1):85-94.
[16] Ferri-Fioni ML, Schmitt E, Soutourina J, Plateau P, Mechulam Y, Blanquet S. Structure of crystalline D-Tyr-tRNA(Tyr) deacylase. A representative of a new class of tRNA-dependent hydrolases. J Biol Chem. 2001;276(50):47285-90.
[17] Lim K, Tempczyk A, Bonander N, Toedt J, Howard A, Eisenstein E, Herzberg O. A catalytic mechanism for D-Tyr-tRNATyr deacylase based on the crystal structure of Hemophilus influenzae HI0670. J Biol Chem. 2003;278(15):13496-502.
[18] Ferri-Fioni ML, Fromant M, Bouin AP, Aubard C, Lazennec C, Plateau P, Blanquet S. Identification in archaea of a novel D-Tyr-tRNATyr deacylase. J Biol Chem. 2006;281(37):27575-85.
[19] Ahmad S, Routh SB, Kamarthapu V, Chalissery J, Muthukumar S, Hussain T, Kruparani SP, Deshmukh MV, Sankaranarayanan R. Mechanism of chiral proofreading during translation of the genetic code. Elife. 2013;2:e01519.
[20] Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J Mol Biol. 1961; 3(2): 208–IN1.
[21] Zerbs S, Frank AM, Collart FR. Bacterial systems for production of heterologous proteins. Methods Enzymol. 2009;463:149-68.
[22] Waugh DS. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 2011;80(2):283-93.
[23] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248-54.
[24] Polayes D. Prokaryotic protein expression and purification with the ProEXTM HT expression system. Focus. 1996; 18(2): 50–3.