Biopolym. Cell. 2014; 30(2):96-106.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000887
Структура та функції біополімерів
Структурний поділ фактора елонгації трансляції 1 Bγ (eEF1Bγ) людини: експресія повнорозмірного білка та його вкорочених форм
1Тросюк Т. В., 1, 2Людковська В. В., 1Шалак В. Ф., 1Негруцький Б. С., 1Єльська А. В.
  1. Державна ключова лабораторія молекулярної і клітинної біології
    Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  2. Інститут генетики та біотехнології, Варшавського університету
    вул. Павінського, 5a, Варшава, Польща, 02-106

Abstract

Мета. Для детального вивчення властивостей фактора елонгації трансляції eEF1Bγ людини і його взаємодії з партнерами оптимізувати експресію кДНК повнорозмірного білка та його вкорочених форм. Методи. кДНК, які кодують вкорочені форми eEF1Bγ, синтезували методом ПЛР-ампліфікації з відповідними праймерами і клонували у вектори, що містять які афінну мітку полігістидинову послідовність, глутатіон S-трансферазу або білок, який зв’язує мальтозу. Рекомбінантні білки експресували в бактеріях і очищували афінною хроматографією. Агрегатний стан отриманих білків аналізували з використанням аналітичної гель-фільтрації. Результати. Оптимізовано експресію, очищення та умови зберігання повнорозмірного рекомбінантного His-eEF1Bγ. Також експресовано і очищено до гомогенного стану кілька вкорочених форм eEF1Bγ. Дві вкорочені форми С-кінцевого домену, які містять амінокислотні залишки 263–437 і 228–437, отримано у вигляді розчинних мономерних білків. Дві вкорочені форми N-кінцевого домену, що містять амінокислотні залишки 1–33 і 1–230, злиті з глутатіон S-трансферазою, одержано у вигляді димерів згідно з результатами гель-фільтрації. Інші делеційні мутанти, які містять амінокислотні залишки 1–93 і 1–165 N-кінцевого домену та злиті з білком, що зв’язує мальтозу, можуть бути отримані лише у вигляді розчинних високомолекулярних агрегатів. Висновки. Отримано і охарактеризовано рекомбінантний білок His-eEF1Bγ та його чотири вкорочені форми. Ці форми в подальшому буде використано для вивчення білково-білкових взаємодій.
Keywords: eEF1Bγ, білкові структурні домени, експресія рекомбінантних білків, хроматографічне очищення білків
Повний текст: (PDF, англійською)

Supplementary data

References

[1] Merrick WC, Nybord J. The protein biosynthesis, elongation cycle. Translational Control of Gene Expression. Eds N. Sonenberg, J. W. B. Hershey, M. B. Mathews. 2000; 89–126.
[2] Janssen GM, Moller W. Elongation factor 1 beta gamma from Artemia. Purification and properties of its subunits. Eur J Biochem. 1988; 171(1–2):119–29.
[3] Kim S, Kellner J, Lee CH, Coulombe PA. Interaction between the keratin cytoskeleton and eEF1Bgamma affects protein synthesis in epithelial cells. Nat Struct Mol Biol. 2007; 14(10):982–3.
[4] Al-Maghrebi M, Brule H, Padkina M, Allen C, Holmes WM, Zehner ZE. The 3' untranslated region of human vimentin mRNA interacts with protein complexes containing eEF-1gamma and HAX-1. Nucleic Acids Res. 2002; 30(23):5017–28.
[5] Deschamps S, Morales J, Mazabraud A, le Maire M, Denis H, Brown DD. Two forms of elongation factor 1 alpha (EF-1 alpha O and 42Sp50), present in oocytes, but absent in somatic cells of Xenopus laevis. J Cell Biol. 1991; 114(6):1109–11.
[6] Jeppesen MG, Ortiz P, Shepard W, Kinzy TG, Nyborg J, Andersen GR. The crystal structure of the glutathione S-transferase-like domain of elongation factor 1Bgamma from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 2003; 278(47):47190–8.
[7] Chi K, Jones DV, Frazier ML. Expression of an elongation factor 1 gamma-related sequence in adenocarcinomas of the colon. Gastroenterology. 1992; 103(1):98–102.
[8] Mimori K, Mori M, Tanaka S, Akiyoshi T, Sugimachi K. The overexpression of elongation factor 1 gamma mRNA in gastric carcinoma. Cancer. 1995; 75(6 Suppl):1446–9.
[9] Veremieva M, Khoruzhenko A, Zaicev S, Negrutskii B, El'skaya A. Unbalanced expression of the translation complex eEF1 subunits in human cardioesophageal carcinoma. Eur J Clin Invest. 2011; 41(3):269–76.
[10] Vanwetswinkel S, Kriek J, Andersen GR, Guntert P, Dijk J, Canters GW, Siegal G. Solution structure of the 162 residue C-terminal domain of human elongation factor 1Bgamma. J Biol Chem. 2003; 278(44):43443–51.
[11] Koonin EV, Mushegian AR, Tatusov RL, Altschul SF, Bryant SH, Bork P, Valencia A. Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma contains a glutathione transferase domain – study of a diverse, ancient protein superfamily using motif search and structural modeling. Protein Sci. 1994; 3(11):2045–54.
[12] Monnier A, Belle R, Morales J, Cormier P, Boulben S, Mulner-Lorillon O. Evidence for regulation of protein synthesis at the elongation step by CDK1/cyclin B phosphorylation. Nucleic Acids Res. 2001; 29(7):1453–7.
[13] Berrow NS, Alderton D, Sainsbury S, Nettleship J, Assenberg R, Rahman N, Stuart DI, Owens RJ. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 2007; 35(6):e45.
[14] Holzinger A, Phillips KS, Weaver TE. Single-step purification/solubilization of recombinant proteins: application to surfactant protein B. Biotechniques. 1996; 20(5):804–6, 808.
[15] Le Sourd F, Boulben S, Le Bouffant R, Cormier P, Morales J, Belle R, Mulner-Lorillon O. eEF1B: At the dawn of the 21st century. Biochim Biophys Acta. 2006; 1759(1–2):13–31.
[16] Sheu GT, Traugh JA. Recombinant subunits of mammalian elongation factor 1 expressed in Escherichia coli. Subunit interactions, elongation activity, and phosphorylation by protein kinase CKII. J Biol Chem. 1997; 272(52):33290–7.
[17] Kamiie K, Yamashita T, Taira H, Kidou S, Ejiri S. Interaction between elongation factors 1beta and 1gamma from Bombyx mori silk gland. Biosci Biotechnol Biochem. 2003; 67(7):1522–9.
[18] Routzahn KM, Waugh DS. Differential effects of supplementary affinity tags on the solubility of MBP fusion proteins. J Struct Funct Genomics. 2002; 2(2):83–92.