Biopolym. Cell. 2013; 29(1):49-54.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000805
Молекулярна та клітинна біотехнології
Конструювання, синтез, функціональна характеристика і практичне застосування злитого білка SPA-ВAPmut
1Горбатюк О. Б., 1, 2Окунєв О. В., 1Ніколаєв Ю. С., 1, 3Святенко О. В., 1, 2Кордюм В. А.
  1. ДУ «Інститут генетичної і регенеративної медицини НАМН України»
    вул. Вишгородська, 67, Київ, Україна, 04114
  2. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  3. Національний авіаційний університет
    пр. Комарова, 1, Київ, Україна, 03058

Abstract

Мета. Створення генно-інженерного злитого білка SPA-BAPmut та його застосування як вторинного імунореагенту в імунологічних тестах. Методи. Клонування генів, ПЛР, секвенування ДНК, культивування бактерій, електрофорез, синтез і очищення білків, ELISA, вестерн-блот. Результати. З використанням послідовновностей ДНК, що кодують білок А Staphylococcus aureus (SPA) і бактерійну лужну фосфатазу з покращеними каталітичними властивостями (BAPmut), сконструйовано ген злитого білка SPA-BAPmut та забезпечено його препаративне отримання у розчинній формі внаслідок синтезу в клітинах Escherichia coli. Визначено умови ферментації, за яких вихід SPA-ВAPmut становить приблизно 1 г/л культури E. coli. Із застосуванням методу металоафінної хроматографії одержано цільовий білок з чистотою понад 95 %. SPA-ВAPmut термостабільний, а обидва його компоненти (SPA і ВAPmut) зберігають імуноглобулінзв’язувальну і фосфатазну активність тривалий час. SPA-BAPmut дозволяє виявляти щонайменше 5 нг антигену та 1 мкг/мл антитіл. Висновки. Показано можливість використання SPA-ВAPmut як універсального вторинного імунореагенту в імунохімічних тестах.
Keywords: білок А, бактерійна лужна фосфатаза, злитий білок, імунодіагностика
Повний текст: (PDF, українською) (PDF, англійською)

References

[1] Moks T., Abrahmsen L., Nilsson B., Hellman U., Sjoquist J., Uhlen M. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains Eur. J. Biochem 1986 156, N 3:637–643.
[2] Hober S., Nord K., Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci 2007 848, N 1:40–47.
[3] Doesch A. O., Mueller S., Konstandin M., CelikS., Frankenstein L., Zugck C., Dengler T. J., Fleming T., Bierhaus A., Katus H. A. Effects of protein A immunoadsorption on methylglyoxal levels in patients with chronic dilated cardiomyopathy and diabetes mellitus Appl. Cardiopulm.Pathophysiol 2011 15:3–13.
[4] Muller B. H., Lamoure C., Le Du M. H., Cattolico L., Lajeunesse E., Lemaitre F., Pearson A., Ducancel F., Menez A., Boulain J. C. Improving Escherichia coli alkaline phosphatase efficacy by additional mutations inside and outside the catalytic pocket Chembiochem 2001 2, N 7–8:517–523.
[5] Gorbatiuk O. B., Tsapenko M. V., Pavlova M. V., Okunev O. V., Kordium V. A. Bioaffinity sorbent based on immobilized protein A Staphylococcus aureus: development and application Biopolym. Cell 2012 28, N 2:141–148.
[6] Studier F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures Protein Expr. Purif 2005 41, N 1:207–234.
[7] Westermeir R. Electrophoresis in practice: a guide to methods and application of DNA and protein separations Weinheim: VCH, 1997 331 p.
[8] Okunev O. V., Gilchuk P. V., Irodov D. M., Deryabina O. G. Obtainaing and characterization of the single chain antibodies against human a2b-interferon. Ukr. Biokhim. Zh. 2005 77, N 5:106–115.
[9] Nikolaiev Iu. S., Gorbatiuk O. B., Tsapenko M. V. The development of strategy for obtaining single-chain recombinant antibodies against cell-surface biomarkers on the example of human CD34 Biopolym. Cell 2010 26, N 6:492–498.
[10] Nilson B., Bjorck L., Akerstrom B. Enzyme linked immunosorbent assay using alkaline phosphatase conjugated with streptococcal protein G J. Immunoassay 1988 9, N 2:207–225.
[11] Zhang L., Buchet R., Azzar G. Distinct structure and activity recoveries reveal differences in metal binding between mammalian and Escherichia coli alkaline phosphatases Biochem. J 2005 392, Pt 2:407–415.
[12] Chowdhury P. S., Kushwaha A., Abrol S., Chaudhary V. K. An expression system for secretion and purification of a genetically engineered thermostable chimera of protein A and alkaline phosphatase Protein Expr. Purif 1994 5, N 1:89–95.