Biopolym. Cell. 2011; 27(4):273-278.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000109
Структура та функції біополімерів
Бактеріальна експресія та мічення ізотопами 13C/15N цитокіну EMAP II для структурних досліджень методом ЯМР-спектроскопії
1Ложко Д. М., 2Жуков І. Ю., 1Корнелюк О. І.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  2. Інститут біохімії і біофізики Польської академії наук
    вул. Павінського, 5a, Варшава, Польща, 02-106

Abstract

Мета. Отримання рекомбінантного цитокіна EMAP II в препаративних кількостях з використанням бактеріальної експресії та його ізотопне мічення для дослідження просторової структури методами мультивимірної ЯМР-спектроскопії. Методи. EMAP II експресовано в клітинах Еscherichia соli BL21 (DE3)pLysE на мінімальному середовищі з міченням ізотопами 13C і 15N та очищено методом метал-хелатуючої хроматографії на Ni-NTA-агарозі. Для перевірки маси і чистоти мічених рекомбінантних білків застосовано метод мас-спектрометрії. Одержано двомірні ЯМР-спектри рекомбінантного цитокіну EMAP II у розчині. Результати. Отримано препарати рекомбінантного білка EMAP II, мічені ізотопами 13C і 15N, які проаналізовано методом ЯМР-спектроскопії. Висновки. Дисперсія сигналів ЯМР у двомірних спектрах 1H/15N і 13C/15N-HSQC підтверджує наявність компактної тривимірної структури білка. Ізотопно мічені препарати EMAP II зберігають стабільність протягом 5–6 днів, що дає можливість подальшого визначення просторової структури білка в розчині методом ЯМР-спектроскопії.
Keywords: цитокін, EMAP II, ізотопне мічення, мас-спектрометрія, ЯМР-спектроскопія, двомірні спектри
Повний текст: (PDF, українською)

References

[1] Ivakhno S. S., Kornelyuk A. I. Cytokine-like activities of some aminoacyl-tRNA synthetases and auxiliary p43 cofactors of aminoacylation reaction and their role in oncogenesis Exp. Oncol 2004 26, N 4 P. 250–255.
[2] Kao J., Ryan J., Brett G., Chen J., Shen H., Fan Y. G., Godman G., Familletti P. C., Wang F., Pan Y. C. et. al. Endothelial monocyte-activating polypeptide II. A novel tumour-derived polypeptide that activates host-response mechanisms J. Biol. Chem 1992 267, N 28 P. 20239–20247.
[3] Schwarz M. A., Kandel J., Brett J., Li J., Hayward J., Schwarz R. E., Chappey O., Wautier J. L., Chabot J., Lo Gerfo P. L., Stern D. Endothelial-monocyte activating polypeptide II, a novel antitumour cytokine that suppresses primary and metastatic tumour growth and induces apoptosis in growing endothelial cells J. Exp. Med 1999 190, N 3 P. 341–354.
[4] Schwarz R. E., Schwarz M. A. In vivo therapy of local tumour progression by targeting vascular endothelium with EMAP-II J. Surg. Res 2004 120, N 1 P. 64–72.
[5] Reznikov A. G., Chaykovskaya L. V., Polyakova L. I., Kornelyuk A. I. Antitumor effect of endothelial monocyte-activating polypeptide-II on human prostate adenocarcinoma in mouse xenograft model Exp. Oncol 2007 29, N 4 P. 267–271.
[6] Shalak V., Kaminska M., Mitnacht-Kraus R., Vandenabeele P., Clauss M., Mirande M. The EMAPII cytokine is released from the mammalian multisynthetase complex after cleavage of its p43/proEMAP II component J. Biol. Chem 2001 276, N 26 P. 23769–23776.
[7] Kornelyuk A. I., Tas M. P. R., Dubrovsky A. L., Murray J. C. Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase Biopolym. Cell 1999 15, N 2. P. 168–172.
[8] Wang C. C., Schimmel P. Species barrier to RNA recognition overcome with nonspecific RNA binding domains J. Biol. Chem 1999 274, N 23 P. 16508–16512.
[9] Kordysh M. A., Kornelyuk A. I. Fluorescence and dynamics of structural environment of Trp125 fluorophore in EMAPII cytokine Visnyk of V. N. Karazin Kharkiv National University. Biophys. Bull 2003 2, N 13 P. 86–90.
[10] Kordysh M. A., Dubrovsky O. L., Kornelyuk A. I. Local conformational transition of Trp125 in EMAP II cytokine inducted by physiological temperature Physics of the Alive 2005 13, N 1 P. 79–85.
[11] Renault L., Kerjan P., Pasqualato S., Menetrey J., Robinson J. C., Kawaguchi S., Vassylyev D. G., Yokoyama S., Mirande M., Cherfils J. Structure of the EMAP II domain of human aminoacyltRNA synthetase complex reveals evolutionary dimer mimicry EMBO J 2001 20, N 3 P. 570–578.
[12] Guntert P. Structural calculations of biological macromolecules from NMR data Q. Rev. Biophys 1998 31, N 2 P. 145–237.
[13] Bradford M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal. Biochem 1976 72 P. 248–254.
[14] Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 1970 277, N 5259 P. 680–685.
[15] Dubrovsky A. L., Brown Jn., Kornelyuk A. I., Murray J. C., Matsuka G. Kh. Bacterial expression of full-length and truncated forms of cytokine EMAP-2 and cytokine-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase Biopolym. Cell 2000 16, N 3 P. 229–235.
[16] Delaglio F., Grzesiek S., Vuister G. W., Zhu G., Pfeifer J., Bax A. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes J. Biomol. NMR 1995 6, N 3 P. 277–293.
[17] Goddard T. D., Kneller D. G. SPARKY 3 San Francisco: Univ. of California, 2008.