Biopolym. Cell. 2011; 27(1):53-58.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000082
Молекулярна та клітинна біотехнології
Експресія і секреція рекомбінантного білка LIF людини генетично модифікованими клітинами ссавців
1Римар С. Ю., 1Рубан Т. А., 1Іродов Д. М., 1Кордюм В. А.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680

Abstract

Мета роботи полягала в одержанні експресії гена LIF людини в генетично модифікованих клітинах ссавців і вивченні секреції рекомбінантного білка цими клітинами в культуральне середовище. Методи. Для визначення рекомбінантного LIF в кондиціонованому середовищі, одержаному в результаті культивування клітин, трансфекованих рекомбінантними плазмідами, що містять ген LIF, використовували Вестерн-блот аналіз та імунопреципітацію. Результати. Сконструйовані рекомбінантні плазміди забезпечують експресію і секрецію рекомбінантного LIF людини клітинами трьох ліній (CHO-K1, L-M(TK–)(ins+) і 293Т), трансфекованих цими плазмідами. Ступінь глікозилювання рекомбінантного LIF, продукованого такими клітинами, варіює, при цьому спостерігається секреція повністю глікозильованого LIF (з молекулярною масою близько 68 кДа). Висновки. Кондиціоноване середовище, одержане внаслідок культивування трансфекованих клітин, можна використовувати як джерело LIF людини для культивування клітин, яким потрібен цей ростовий фактор, а також для його виділення в очищеному стані
Keywords: рекомбінантний LIF, експресія, секреція, трансфекція, клітинні лінії
Повний текст: (PDF, російською) (PDF, англійською)

References

[1] Auernhammer C. J., Melmed S. Leukemia inhibitory factor – neuroimmune modulator of endocrine function Endocrin. Revs 2000 21, N 3 P. 313–345.
[2] Matsuda T., Nakamura T., Nakao K. T., Katsuki M., Heike T., Yokota T. STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells EMBO J 1999 18, N 15:4261–4269.
[3] Zandstra P. W., Le H. V., Daley G. Q., Griffith L. G., Lauffenburger D. A. Leukemia inhibitory factor (LIF) concentration modulates embryonic stem cell self-renewal and differentiation independently of proliferation Biotechnol. Bioeng 2000 69, N 6:607–617.
[4] Wright L. S., Li J., Caldwell M. A., Wallace K., Johnson J. A., Svendsen C. N. Gene expression in human neural stem cells: effects of leukemia inhibitory factor J. Neurochem 2003 86, N 1:179–195.
[5] Carpentera M. K., Cuib X., Hua Z., Jacksona J., Shermana S., Seigerc A., Wahlberga L. U. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells Exp. Neurol 1999 158, N 2:265–278.
[6] Pat. USA 7109032. Serum-free medium for mesenchymal stem cells / R. Cancedda, B. Dozin Publ. 09/19/2006.
[7] Pat. USA 6432711. Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines / J. H. Dinsmore, J. Ratliff Publ. 8/13/2002.
[8] Pat. USA 7534607. Method of producing cardiomyocytes from mesenchymal stem cells / W. Chen, S. Lin Publ. 19.05.2009.
[9] Dimaracis I., Levicar N., Nihoyannopoulos P. In vitro stem cell differentiation into cardiomyocytes: Part 1.Culture medium and growth factors J. Cardiothor. Renal Res 2006 1, N 2 :107–114.
[10] Gearing P. D., Gough N. M., King J. A., Hilton D. J., Nicola N. A., Simpson R. J., Nice E. C., Kelso A., Metcalf D. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF) EMBO J 1987 6, N 13 : 3995–4002.
[11] Brinsden P. R., Alam V., De Moustier B., Engrand P. Recombinant human leukemia inhibitory factor does not improve implantation and pregnancy outcomes after assisted reproductive techniques in women with recurrent for unexplained implantation failure Fertil. Steril 2009 91, N 4 :1445–1447.
[12] Hossler P., Khattak S. F., Jian Z. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture// Glycobiology 2009 19, N 9 P. 936–949.
[13] Pat. USA 6673575. Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation / F. Reinhard, E. Horst, W. Claus Publ. 10.06.1999.
[14] Bork K., Horstkorte R., Weidemann W. Increasing the sialylation of therapeutic glycoproteins: The potential of the sialic acid biosynthetic pathway J. Pharmaceutic. Sci 2009 98, N 10 P. 3499–3508.
[15] Pat. USA 7118746. Conditioned cell culture medium compositions and methods of use / G. K. Naughton, D. L. Horwitz, M. A. Applegate, J. Zeltinger, J. N. Mansbridge, A. Kern, L. K. Landeen, A. Ratcliffe, R. E. Pinney Publ.10.10.2006.
[16] Pat. USA 7723105. Conditioned cell culture medium, method to obtained the same and use of it for maintenance, proliferation and differentiation of mammalian cells / V. Bordoni, T. Alonzi, M. Tripodi Publ. 5/25/2010.
[17] Makino H., Hasuda H., Ito Y. Immobilization of leukemia inhibitory factor (LIF) to culture murine embryonic stem cells J. Biosci. Bioeng 2004 98, N 5 P. 374–379.
[18] Kameda T., Sugiyama T. Application of genetically modified feeder cells for culture of keratinocytes Meth. Mol. Biol 2005 289, N 1 P. 29–38.
[19] Sidhu K. S., Lie K. H., Tuch B. E. Transgenic human fetal fibroblasts as feeder layer for human embryonic stem cell lineage selection Stem Cells Dev 2006 15, N 5 P. 741–747.
[20] Unger C., Gao S.,Cohen M., Jaconi M., Bergstrom R., Holm F., Galan A., Sanchez E., Irion P., Dubuisson J. B., Giry-Laterriere M., Salmon P., Simon C., Hovatta O., Feki A. Immortalized human skin fibroblast feeder cells support growth and maintenance of both human embryonic and induced pluripotent stem cells Hum. Reprod 2009 24, N 10 P. 2567– 2581.
[21] Jayapal K. P., Wlaschin K. F., Yap M. G. S., Hu W.-S. Recombinant protein therapeutics from CHO cells – 20 years and counting Chem. Eng. Prog 2007 103, N 7 P. 40–47.
[22] Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual New York: Cold Spring Harbor Lab. publ., 1982 545 p.
[23] Geisse S., Henke M. Large-scale transient transfection of mammalian cells: a newly emerging attractive option for recombinant protein production J. Struct. Funct. Genomics 2005 6, N 2–3 P. 165–170.
[24] Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 1970 227, N 5259:680–685.
[25] Schmelzer C. H., Harris R. J., Butler D., Yedinak C. M., Wagner K. L., Burton L. E. Glycosylation pattern and disulfide assignment of recombinant human differentiation-stimulating factor Arch. Biochem. Biophys 1993 302, N 2 P. 484–489.
[26] Schmelzer C. H., Burton L. E., Tamony C. M. Purification and partial characterization of recombinant human differentiation-stimulating factor Protein Exp. Purific 1990 1, N 1 P. 54–62.
[27] Pat. USA 004098. Leukemia inhibitory factor / N. M. Gough, T. A. Willson, D. Metcalf, D. J. Hilton, E. C. Nice, N. A. Nicola, R. J. Simpson, J. A. King, D. P. Gearing Publ. 02.01.2003.
[28] Gascan H., Anegon I., Praloran V., Naulet J., Godard A., Soulillou J. P., Jacques Y. Constitutive production of human interleukin for DA cells/leukemia inhibitory factor by human tumor cell lines derived from various tissues J. Immunol 1990 144, N 7 P. 2592–2598.
[29] Godard A., Gascan H., Naulet J., Peyrat M. A., Jacques Y., Soulillou J. P., Moreau J. F. Biochemical characterization and purification of HILDA, a human lymphokine active on eosinophils and bone marrow cells Blood 1988 71, N 6 P. 1618–1623.