Biopolym. Cell. 2010; 26(1):51-55.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000144
Геноміка, транскриптоміка та протеоміка
Застосування кількісної ПЛР у реальному часі для молекулярно-генетичної діагностики спінальної м’язoвої атрофії
1Соловйов О. О., 1Лівшиць Г. Б., 1Подлєсна С. С., 1Лівшиць Л. А.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680

Abstract

Мета роботи полягала у розробці простого і надійного методу кількісного аналізу делеції 7-го екзону гена SMN1 за допомогою ПЛР у реальному часі з барвником-інтеркалятором SYBR Green, який можна використовувати в тест-системах для діагностики спінальної м’язової атрофії (СМА). Методи. Для розробки методу визначення кількості копій гена SMN1 застосовано підхід, який базується на порівнянні параметрів ампліфікації досліджуваного зразка ДНК та зовнішнього стандарту (ген альбуміну). Для підтвердження розробленого методу проаналізовано зразки ДНК 10 паціентів із СМА (гомозиготна делеція 7-го екзону гена SMN1), 42 контрольних зразки ДНК (від 29 гетерозиготних носіїв делеції 7-го екзону гена SMN1 і 13 індивідуумів без делеціії), які вивчено методом зчеплення з поліморфними мікросателітними маркерами 2AE9.1 (D5S557) і LAS96 (D5S681), а також зразки від 10 індивідуумів з контрольної популяції. Обробку результатів проводили за допомогою стандартного методу Лівака (метод 2–ΔΔCt). Результати. Середнє значение зі стандартною похибкою показника 2–ΔΔCt для гетерозиготних носіїв делеції 7-го екзону гена SMN1 становить 0,475 ± 0,091, для нормальних контролів – 0,909 ± 0,068. Встановлено відсутність перекривання результатів аналізу для гетерозиготних носіїв делеції і нормальних контролів (t = 3,84, p > 0,05). Висновки. Розроблений метод може бути придатним для аналізу СМА у програмах молекулярно-генетичного тестування, а також як компонент тест- систем для діагностики СМА.
Keywords: спінальна м’язoва атрофія, ген SMN1, делеція, ПЛР у реальному часі
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Ekshiian A. Iu., Livshits L. A., Bychkova A. M., Afanas'eva N. A., Bariliak I. R. A molecular genetic analysis of spinal muscular atrophy (SMA) in families at high risk from different regions of Ukraine. Tsitol. Genet. 1997 31, N 6 P. 75–81.
[2] Munsat T. L., Davies K. E. International SMA consortium meeting Neuromuscul. Disord 1992 2, N 5–6 P. 423–428.
[3] Lefebvre S., Burglen L., Reboullet S., Clermont O., Burlet P., Viollet L., Benichou B., Cruaud C., Millasseau P., Zeviani M., Le Paslier D., Frezal J., Cohen D., Weissenbach J., Munnich A., Melki J. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell 1995; 80, N 1 P. 155–165.
[4] Melki J., Lefebvre S., Burglen L., Burlet P., Clermont O., Millasseau P., Reboullet S., Benichou B., Zeviani M., Le Paslier D., Cohen D., Weissenbach J., Munnich A. De novo and inherited deletions of the 5q13 region in spinal muscular atrophies. Science 1994 264, N 5164 P. 1474–1477.
[5] Lorson C. L., Hahnen E., Androphy E. J., Wirth B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1999 96, N 11 P. 6307–6311.
[6] Monani U. R., Lorson C. L., Parsons D. W., Prior T. W., Androphy E. J., Burghes A. H., McPherson J. D. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2 Hum. Mol. Genet 1999 8, N 7 P. 1177–1183.
[7] Livshits G. B., Hryshchenko N. V., Podlesna S. S., Ekshiian A. Iu. Molecular-genetic analysis of spinal muscular atrophy in Ukrainian patients. Int. Neurol. J. 2009; 26, N 4 P. 20–22.
[8] Ogino S., Leonard D., Rennert H., Wilson R. B. Spinal muscular atrophy genetic testing experience at an academic medical center. J. Mol. Diagn 2002 4, N 1 P. 53–58.
[9] McAndrew P. E., Parsons D. W., Simard L. R., Rochette C., Ray P. N., Mendell J. R., Prior T. W., Burghes A. H. Identification of proximal spinal muscular atrophy carriers and patients by analysis of SMNT and SMNC gene copy number Am. J. Hum. Genet 1997 60, N 6 P. 1411–1422.
[10] Ogino S., Leonard D. G. B., Rennert H., Gao S., Wilson R. B. Heteroduplex formation in SMN gene dosage analysis J. Mol. Diagn 2001 3, N 4 P. 150–157.
[11] Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual New York: Cold Spring Harbor Lab. publ., 1982 545 p.
[12] Kim S. W., Lee K. S., Jin H. S., Lee T. M., Koo S. K., Lee Y. J., Jung S. C. Rapid detection of duplication/deletion of the PMP22 gene in patients with Charcot-Marie-Tooth disease type 1A and hereditary neuropathy with liability to pressure palsy by real-time quantitative PCR using SYBR Green I dye. J. Korean. Med. Sci 2003; 18, N 5 P. 727–732.
[13] Livak K. J., Schmittgen T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–CT method Methods 2001 25 P. 402–408.
[14] Chen K. L., Wang Y. L., Rennert H., Joshi I., Mills J. K., Leonard D. G., Wilson R. B. Duplications and de novo deletions of the SMNt gene demonstrated by fluorescence-based carrier testing for spinal muscular atrophy. Am. J. Med. Genet 1999 85, N 5 P. 463–469.