Biopolym. Cell. 2008; 24(1):51-59.
Молекулярна та клітинна біотехнології
Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli
1, 2Горбатюк О. Б., 1, 2Ніколаєв Ю. С., 2Іродов Д. М., 2Дубей І. Я., 2Гільчук П. В.
  1. Київський національний університет імені Тараса Шевченка
    вул. Володимирська 64, Київ, Україна, 01601
  2. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680

Abstract

Запропоновано ефективний і недорогий метод ренатурації химерного білка ScFv-CBD із тілець включення E. coli. Метод грунтується на ступінчастому розведенні солюбілізованого в розчині 6 М гуанідингідрохлориду ScFv-CBD буфером для ренатурації, який містить L-аргінін та глутатіон. Досліджено вплив вихідної концентрації білка та різного співвідношення реагентів окисно-відновної пари GSSG:GSН, які додавали на певних стадіях ренатурації, на вихід функціонально активного ScFv-CBD і його агрегацію. Показано, що зниження виходу активного ScFv-CBD відбувається за рахунок формування значної кількості його розчинних агрегатів при вихідній концентрації, вищій за 0,53 мг/мл. Визначено умови ренатурації, які забезпечують найбільший вихід розчинного ScFv-CBD у мономерній формі, та найвищу функціональну активність його антигензв’язувального (ScFv) і целюлозозв’язувального (CBD) компонентів (відповідно ~63 і ~96 %).
Keywords: химерний білок, тільця включення, ренатурація, одноланцюгові антитіла, целюлозозв’язувальний домен

References

[1] Vallejo LF, Rinas U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 2004;3(1):11.
[2] Tsumoto K, Ejima D, Kumagai I, Arakawa T. Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies. Protein Expr Purif. 2003;28(1):1-8.
[3] Gilchuk P. V. Evaluation of renaturation methods for industrial obtaining of recombinant proteins from Escherichia coli inclusion bodies in biologically active form. Biopolym. Cell. 2004; 20(3):182-192.
[4] Moroney S., Pluckthun, A. Modern Antibody Technology: The Impact on Drug Development (2008) Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 3, pp. 1147-1186.
[5] Blazek D, Celer V. The production and application of single-chain antibody fragments. Folia Microbiol (Praha). 2003;48(5):687-98.
[6] Skerra A, Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science. 1988;240(4855):1038-41.
[7] Glockshuber R, Schmidt T, Pl?ckthun A. The disulfide bonds in antibody variable domains: effects on stability, folding in vitro, and functional expression in Escherichia coli. Biochemistry. 1992;31(5):1270-9.
[8] Skerra A, Pluckthun A. Secretion and in vivo folding of the Fab fragment of the antibody McPC603 in Escherichia coli: influence of disulphides and cis-prolines. Protein Eng. 1991;4(8):971-9.
[9] Ge L., Knappik A., Pack P., Freund C., Pluckthun A. Expression antibodies in Escherichia coli. Antibody Engineering, Ed. C. A. Borrebaeck. Oxford: Univ. press 1995; 229-266.
[10] Gilchuk P.V. Rozrobka texnolohiyi oderzhannya odnolancyuhovyx antytil v Escherichia coli: dys... kand. biol. nauk: / Kyyivs"kyj nacional"nyj un-t im. Tarasa Shevchenka. K., 2006.
[11] Gilchuk P.V., Okunev O.V., Pavlova M.V., Irodov D.M., Gorbatyuk O.B. Obtaining of scfv-cbd fusion protein and its application for affinity purification of recombinant human interferon a2b. Ukr Biokhim Zh. 2006;78(2):52-61.
[12] Gilchuk PV, Volkov GL. Immobilization of mouse single-chain antibodies for affinity chromatography using the cellulose-binding protein. Ukr Biokhim Zh. 2006;78(4):160-3.
[13] Westermeier R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations, Weinheim: VCH 1997 p. 331.
[14] Tsumoto K, Shinoki K, Kondo H, Uchikawa M, Juji T, Kumagai I. Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment. J Immunol Methods. 1998;219(1-2):119-29.
[15] Umetsu M, Tsumoto K, Hara M, Ashish K, Goda S, Adschiri T, Kumagai I. How additives influence the refolding of immunoglobulin-folded proteins in a stepwise dialysis system. Spectroscopic evidence for highly efficient refolding of a single-chain Fv fragment. J Biol Chem. 2003;278(11):8979-87.
[16] Tsumoto K, Umetsu M, Kumagai I, Ejima D, Philo JS, Arakawa T. Role of arginine in protein refolding, solubilization, and purification. Biotechnol Prog. 2004;20(5):1301-8.
[17] Sinacola JR, Robinson AS. Rapid refolding and polishing of single-chain antibodies from Escherichia coli inclusion bodies. Protein Expr Purif. 2002;26(2):301-8.
[18] Raina S, Missiakas D. Making and breaking disulfide bonds. Annu Rev Microbiol. 1997;51:179-202.
[19] Tormo J, Lamed R, Chirino AJ, Morag E, Bayer EA, Shoham Y, Steitz TA. Crystal structure of a bacterial family-III cellulose-binding domain: a general mechanism for attachment to cellulose. EMBO J. 1996;15(21):5739-51.
[20] Berdichevsky Y, Lamed R, Frenkel D, Gophna U, Bayer EA, Yaron S, Shoham Y, Benhar I. Matrix-assisted refolding of single-chain Fv- cellulose binding domain fusion proteins. Protein Expr Purif. 1999;17(2):249-59.