Biopolym. Cell. 1995; 11(6):57-61.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000404
Синтез та характеристика флюорогенного пептидного субстрату ВІЛ-1 протеази на основі флюоресцентного резонансного переносу енергії
1Корнелюк О. І., 1Терентьєв А. Г., 2Фішер С., 2Портер Т.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  2. SmithKline Beecham plc,
    США

Abstract

Проведено хімічний синтез флюорогенного пептидного субстрату ВІЛ-1 протеази, що має структуру Dns-SQNYPIVWL і відповідає сайту розщеплення р17/р24 у gag-поліпротеіні вірусу імунодефіциту людини.Принцип використання даного субстрату базується на резонансному переносі енергії збудження між донором – залишком Trp і акцептором – дансильною групою. Встановлено, що гідроліз флюорогенного пептидного субстрату рекомбінантною ВІЛ-1 протеа­зою призводить до падіння інтенсивності флюоресценції дансильної групи і одночасного зростання триптофанової флюоресценції внаслідок порушення резонансного переносу енергії між донором і акцептором. За допомогою високоефективної рідинної хроматографії в оберненій фазі зафіксовано появу пептидів, які є продуктами гідролізу субстрату. Визначено кінетичні параметри гідролізу флюорогенного пептидного субстрату ВІЛ-1 протеазою: КМ – 29 мкМ, kcat– 5,4 с–1 та kcat/KM – 180 000 M–1c–1
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Krausslich HG, Wimmer E. Viral proteinases. Annu Rev Biochem. 1988;57:701-54.
[2] Wlodawer A, Miller M, Jaskólski M, Sathyanarayana BK, Baldwin E, Weber IT, Selk LM, Clawson L, Schneider J, Kent SB. Conserved folding in retroviral proteases: crystal structure of a synthetic HIV-1 protease. Science. 1989;245(4918):616-21.
[3] Kohl NE, Emini EA, Schleif WA, Davis LJ, Heimbach JC, Dixon RA, Scolnick EM, Sigal IS. Active human immunodeficiency virus protease is required for viral infectivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85(13):4686-90.
[4] Mitsuya H, Yarchoan R, Broder S. Molecular targets for AIDS therapy. Science. 1990;249(4976):1533-44.
[5] Meek TD. Inhibitors of HIV-1 protease. J Enzyme Inhib. 1992;6(1):65-98.
[6] Wlodawer A, Erickson JW. Structure-based inhibitors of HIV-1 protease. Annu Rev Biochem. 1993;62:543-85.
[7] Craig JC, Duncan IB, Whittaker L, Roberts NA. Antiviral synergy between inhibitors of HIV proteinase and reverse transcriptase. Antiviral Chem. Chemother. 1993;4: 161-6.
[8] Tomaszek TA Jr, Magaard VW, Bryan HG, Moore ML, Meek TD. Chromophoric peptide substrates for the spectrophotometric assay of HIV-1 protease. Biochem Biophys Res Commun. 1990;168(1):274-80.
[9] Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer. Science. 1990;247(4945):954-8.
[10] Wang GT, Matayoshi E, Jan Huffaker H, Krafft GA. Design and synthesis of new fluorogenic HIV protease substrates based on resonance energy transfer. Tetrahedron Letters. 1990;31(45):6493–6.
[11] Geohegan KF, Spencer RW, Danley DE, Contillo LG Jr, Andrews GC. Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human immunodeficiency virus-1. FEBS Lett. 1990;262(1):119-22.
[12] Wu P, Brand L. Resonance energy transfer: methods and applications. Anal Biochem. 1994;218(1):1-13.
[13] Latt SA, Auld DS, Vallee BL. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 1972;50(1):56-62.
[14] Meek TD, Dayton BD, Metcalf BW, Dreyer GB, Strickler JE, Gorniak JG, Rosenberg M, Moore ML, Magaard VW, Debouck C. Human immunodeficiency virus 1 protease expressed in Escherichia coli behaves as a dimeric aspartic protease. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(6):1841-5.
[15] Gershkovich AA, Kibirev V.K. Synthesis of peptides. Reagents and methods. Kiev: Naukova dumka, 1987; 264 p.
[16] Roeske RW, Gesellchen PD. Reaction of potassium salts of boc amino acids with chloromethyl polystyrene catalyzed by 18-crown-6. Tetrahedron Letters. 1976;17(38):3369–72.
[17] Filippova I. Yu., Lysogorskaya E. N., Oksenoit E. S., Komarov Yu. E., Stepanov V. M. Intramolecularly quenched fluorescent substrates for aspartic proteinases. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 1986; 12 (9):1172-1180.
[18] Darke PL, Nutt RF, Brady SF, Garsky VM, Ciccarone TM, Leu CT, Lumma PK, Freidinger RM, Veber DF, Sigal IS. HIV-1 protease specificity of peptide cleavage is sufficient for processing of gag and pol polyproteins. Biochem Biophys Res Commun. 1988;156(1):297-303.