Biopolym. Cell. 2018; 34(2):117-126.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000976
Молекулярна та клітинна біотехнології
Двоцільова стратегія виявлення Chlamydia trachomatis за допомогою ПЛР у реальному часі
1Вітренко Я. А., 1Дерябін О. М.
  1. Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів
    вул. Донецька, 30, Київ, 03151

Abstract

Мета. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) є ключовим методом діагностики C. trachomatis. Мішенню тестів першого покоління є криптична плазміда, що забезпечує досить високу чутливість. Однак придатність цих тестів була поставлена під сумнів після відкриття штамів, в яких був відсутній цільовий сегмент ДНК, і такі варіанти не виявлялись у ПЛР (т.з. «шведські» варіанти). Більш того, існують варіанти, повністю позбавлені плазміди. У цій роботі ми пропонуємо використовувати хромосомний ген в якості додаткової мішені, що дозволить підстрахувати плазмідні ПЛР-тести і може підвисити загальну ефективність діагностики. Методи. Мультиплексна система із двох ПЛР була укладена для одночасної детекції криптичної плазміди і фрагменту гена 16s рРНК. Праймери на 16s рРНК можуть давати сигнал ПЛР при аналізі низки видів Chlamydia. Додання зонду типу Taqman (необхідного для ПЛР у реальному часі) звужує спектр виявлюваних видів до C. trachomatis. В той же час ПЛР з плазміди є специ-фічною виключно до C. trachomatis. Результати. Чутливість ПЛР з плазміди і гену 16s рРНК сягала від 1 до 10 ге-ном-еквівалентів на реакцію, а ефективність ПЛР була близько 100%. Постановка реакцій в мультиплексі не зме-ншувало аналітичну чутливість. Додання реакційної суміші ДНК, приготованої із клінічних зразків, не впливало на ПЛР з чистої ДНК C. trachomatis, що також демонструє надійність системи. Кінетика цих двох реакцій була порів-няна в 49 зразках ДНК із мазків позитивних по C. trachomatis. В 45 із цих зразків реакції показали добру кореляцію порогових циклів ампліфікації Cq – основного аналітичного параметра ПЛР у реальному часі. Висновки. Одночас-на детекція хромосомної та плазмідної мішеней у мультиплексній ПЛР забезпечує високу чутливість і має особли-ві переваги для зразків, де плазміда може бути втрачена в результаті деградації ДНК чи контр-селекції при терапії. Двоцільова стратегія ПЛР, яка представлена в цій роботі, може бути покладена в основу ефективного внутрішньо-лабораторного чи комерційного діагностичного тесту.
Keywords: Chlamydia trachomatis, ПЛР у реальному часі, ген 16s рРНК, криптична плазміда
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Hooppaw AJ, Fisher DJ. A Coming of Age Story: Chlamydia in the Post-Genetic Era. Infect Immun. 2015;84(3):612-21.
[2] Beatty WL, Morrison RP, Byrne GI. Persistent chlamydiae: from cell culture to a paradigm for chlamydial pathogenesis. Microbiol Rev. 1994;58(4):686-99. Review.
[3] Elwell C, Mirrashidi K, Engel J. Chlamydia cell biology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol. 2016;14(6):385-400.
[4] Lanjouw E, Ouburg S, de Vries HJ, Stary A, Radcliffe K, Unemo M. 2015 European guideline on the management of Chlamydia trachomatis infections. Int J STD AIDS. 2016;27(5):333-48.
[5] Carlson JH, Whitmire WM, Crane DD, Wicke L, Virtaneva K, Sturdevant DE, Kupko JJ 3rd, Porcella SF, Martinez-Orengo N, Heinzen RA, Kari L, Caldwell HD. The Chlamydia trachomatis plasmid is a transcriptional regulator of chromosomal genes and a virulence factor. Infect Immun. 2008;76(6):2273-83.
[6] Ostergaard L, Birkelund S, Christiansen G. Use of polymerase chain reaction for detection of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol. 1990;28(6):1254-60.
[7] Palmer L, Falkow S. A common plasmid of Chlamydia trachomatis. Plasmid. 1986;16(1):52-62.
[8] Unemo M, Clarke IN. The Swedish new variant of Chlamydia trachomatis. Curr Opin Infect Dis. 2011;24(1):62-9.
[9] Seth-Smith HM, Harris SR, Persson K, Marsh P, Barron A, Bignell A, Bjartling C, Clark L, Cutcliffe LT, Lambden PR, Lennard N, Lockey SJ, Quail MA, Salim O, Skilton RJ, Wang Y, Holland MJ, Parkhill J, Thomson NR, Clarke IN. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 2009;10:239.
[10] An Q, Olive DM. Molecular cloning and nucleic acid sequencing of Chlamydia trachomatis 16S rRNA genes from patient samples lacking the cryptic plasmid. Mol Cell Probes. 1994;8(5):429-35.
[11] Yeow TC, Wong WF, Sabet NS, Sulaiman S, Shahhosseini F, Tan GM, Movahed E, Looi CY, Shankar EM, Gupta R, Arulanandam BP, Hassan J, Abu Bakar S. Prevalence of plasmid-bearing and plasmid-free Chlamydia trachomatis infection among women who visited obstetrics and gynecology clinics in Malaysia. BMC Microbiol. 2016;16:45.
[12] Dutilh B, Bébéar C, Rodriguez P, Vekris A, Bonnet J, Garret M. Specific amplification of a DNA sequence common to all Chlamydia trachomatis serovars using the polymerase chain reaction. Res Microbiol. 1989;140(1):7-16. PubMed
[13] Pickett MA, Everson JS, Pead PJ, Clarke IN. The plasmids of Chlamydia trachomatis and Chlamydophila pneumoniae (N16): accurate determination of copy number and the paradoxical effect of plasmid-curing agents. Microbiology. 2005;151(Pt 3):893-903.
[14] Patel AL, Sachdev D, Nagpal P, Chaudhry U, Sonkar SC, Mendiratta SL, Saluja D. Prevalence of Chlamydia infection among women visiting a gynaecology outpatient department: evaluation of an in-house PCR assay for detection of Chlamydia trachomatis. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2010;9:24.
[15] Monstein HJ, Kihlström E, Tiveljung A. Detection and identification of bacteria using in-house broad range 16S rDNA PCR amplification and genus-specific DNA hybridization probes, located within variable regions of 16S rRNA genes. APMIS. 1996;104(6):451-8.
[16] Gong S, Yang Z, Lei L, Shen L, Zhong G. Characterization of Chlamydia trachomatis plasmid-encoded open reading frames. J Bacteriol. 2013;195(17):3819-26.
[17] Chiang CS, Liu CP, Weng LC, Wang NY, Liaw GJ. Presence of beta-lactamase gene TEM-1 DNA sequence in commercial Taq DNA polymerase. J Clin Microbiol. 2005;43(1):530-1.
[18] Mylonas I. Female genital Chlamydia trachomatis infection: where are we heading? Arch Gynecol Obstet. 2012;285(5):1271-85.
[19] Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 2010;201 Suppl 2:S134-55.
[20] Phillipson L, Gordon R, Telenta J, Magee C, Janssen M. A review of current practices to increase Chlamydia screening in the community--a consumer-centred social marketing perspective. Health Expect. 2016;19(1):5-25. http://dx.doi.org/10.1111/hex.12337