Biopolym. Cell. 2002; 18(2):102-109.
Використання дріжджової двогібридної системи для пошуку S6K1 та S6K2 зв'язуючих партнерів
1Живолуп О. М., 1Немазаний І. О., 1Побігайло Н. В., 1Панасюк Г. Г., 1Пальчевський С. С., 1Кухаренко О. П., 1Савінська Л. О., 1Овчаренко Г. В., 1Вудмаска М. І., 1, 2Гут І. Т., 1Мацука Г. Х., 1Філоненко В. В.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03680
  2. Людвіговскій інститут дослідження раку, Лондонське відділення
    91, Райдінг Хауз стріт, Лондон, Велика Британія, WIP8BT

Abstract

Кіназа рибосомного білка S6 (S6K) задіяна в сигнальних механізмах регуляції проліферації, диференціації та клітинного росту. На сьогодні відомо дві форми S6K (S6K1 та 2), які мають цитоплазматичний та ядерний сплайсингові варіанти. Відомо лише декілька фізіологічних суб­стратів S6K і партнерів її білково-білкової взаємодії. Для пошуу нових партнерів взаємодії з S6K1 та 2 нами використано дріжджову двогібридну систему. За допомогою аналізу шести створених "bait"-конструктів виявлено, що тільки повнорозмірна форма S6K1 відповідала вимогам двогібридного скринінгу. Великомасштабний скринінг кДНКової бібліотеки ембріона миші дозволив нам виявити 26 позитивних клонів, 13 з яких підтверджено методом статевого злиття. Рестрикційні дослідження і аналіз послідовностей даних клонів показали, що всі вони містять кДНК розміром близько 4000 п. н. з однаковою картиною рестрикції та послідов­ностями на 5'- та 3'-кінцях. Порівняння отриманих послідовностей з геномными та білковими банками даних засвідчило, що кДНК одержаних клонів кодує фрагмент нового білка. Первинна структура даного білка та особливості його взаємодії з S6K знаходяться в процесі вивчення.

References

[1] Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 1995;59(1):94-123.
[2] Gyuris J, Golemis E, Chertkov H, Brent R. Cdi1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell. 1993;75(4):791-803.
[3] Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(21):9578-82.
[4] Vojtek AB, Hollenberg SM, Cooper JA. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 1993;74(1):205-14.
[5] Wang T, Donahoe PK, Zervos AS. Specific interaction of type I receptors of the TGF-beta family with the immunophilin FKBP-12. Science. 1994;265(5172):674-6.
[6] Shih HM, Goldman PS, DeMaggio AJ, Hollenberg SM, Goodman RH, Hoekstra MF. A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions: identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(24):13896-901.
[7] Dufner A, Thomas G. Ribosomal S6 kinase signaling and the control of translation. Exp Cell Res. 1999;253(1):100-9.
[8] Lane HA, Fernandez A, Lamb NJ, Thomas G. p70s6k function is essential for G1 progression. Nature. 1993;363(6425):170-2.
[9] Gout I, Minami T, Hara K, Tsujishita Y, Filonenko V, Waterfield MD, Yonezawa K. Molecular cloning and characterization of a novel p70 S6 kinase, p70 S6 kinase beta containing a proline-rich region. J Biol Chem. 1998;273(46):30061-4.
[10] Chou MM, Blenis J. The 70 kDa S6 kinase complexes with and is activated by the Rho family G proteins Cdc42 and Rac1. Cell. 1996;85(4):573-83.
[11] Peterson RT, Desai BN, Hardwick JS, Schreiber SL. Protein phosphatase 2A interacts with the 70-kDa S6 kinase and is activated by inhibition of FKBP12-rapamycinassociated protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(8):4438-42.
[12] Akimoto K, Nakaya M, Yamanaka T, Tanaka J, Matsuda S, Weng QP, Avruch J, Ohno S. Atypical protein kinase Clambda binds and regulates p70 S6 kinase. Biochem J. 1998;335 (Pt 2):417-24.
[13] Miller JH. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, 466 p.
[14] Estojak J, Brent R, Golemis EA. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Mol Cell Biol. 1995;15(10):5820-9.
[15] Berry DR. The Biology of Yeasts. Hodder & Stoughton Educational. 1982; 64 p.