Синтез і характеристика неінфекційної кільцевої РНК латентного віроїду хмелю з використанням самосплайсингової системи рибозиму групи I
DOI:
https://doi.org/10.7124/bc.000B12Ключові слова:
латентний віроїд хмелю, канабіс, пермутований інтрон групи I, транскрипція in vitro, circRNAАнотація
Мета. Латентний віроїд хмелю (HLVd) становить серйозну загрозу для культивування Cannabis sativa, з рівнем зараження до 90% і втратою 70% ТГК. Для діагностики необхідні надійні неінфекційні позитивні контролі. Методи. Ми синтезували неінфекційну кільцеву РНК HLVd за допомогою самосплайсингової рибозимної системи групи I. Продукт був охарактеризований за допомогою розщеплення РНКази R, RT-PCR та секвенування для підтвердження циклюляризації та послідовності з’єднання, отриманої з рибозиму. Результати: Структурний аналіз показав, що синтетична РНК зберігає високу стабільність (ΔG = -90,4 ккал/моль) порівняно з нативним HLVd (ΔG = -93,8 ккал/моль), із введеними мутаціями, що запобігають реплікації. Молекула залишалася стабільною при температурі від -20°C до 37°C протягом 10 днів і працювала як позитивний контроль ПЛР. Висновки. Синтетична circRNA HLVd забезпечує безпечний, стабільний позитивний контроль для діагностики та модель для дослідження вірусів, усуваючи ключову прогалину в сучасних методах виявлення.Посилання
Pallas V, Navarro A, Flores, R. Isolation of a viroid-like RNA from hop different from hop stunt viroid. J Gen Virol. 1987; 68(12):3201-5.
Matousek J, Patzak J. A low transmissibility of Hop latent viroid through a generative phase of Humulus lupulus L. Biol Plant. 2000; 43(1):145-8.
Bektaş A, Hardwick KM, Waterman K, Kristof J. Occurrence of Hop latent viroid in Cannabis sativa with symptoms of cannabis stunting disease in California. Plant Dis. 2019; 103(10):2699.
Warren JG, Mercado J, Grace D. Occurrence of Hop latent viroid causing disease in Cannabis sativa in California. Plant Dis. 2019; 103(10):2699-2699.
Sano T. Progress in 50 years of viroid research-Molecular structure, pathogenicity, and host adaptation. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2021; 97(7):371-401.
Takeda R, Ding B. Viroid intercellular trafficking: RNA motifs, cellular factors and broad impacts. Viruses. 2009; 1(2):210-21.
Torres A, Pauli C, Givens R, Argyris J, Allen K, Monfort A, Gaudino RJ. High-throughput methods to identify male Cannabis sativa using various genotyping methods. J Cannabis Res. 2022; 4(1):57.
Flores R, Hernández C, Martínez de Alba AE, Daròs JA, Di Serio F. Viroids and viroid-host interactions. Annu Rev Phytopathol. 2005; 43:117-39.
Adkar-Purushothama CR, Sano T, Perreault JP. Hop Latent Viroid: A Hidden Threat to the Cannabis Industry. Viruses. 2023; 15(3):681.
Barbara DJ, Morton A, Adams AN, Green CP. Some Effects of Hop Latent Viroid on Two Cultivars of Hop (Humulus Lupulus) in the UK. Ann Appl Biol. 1990; 117(2):359-66.
Atallah OO, Yassin SM, Verchot J. New Insights into Hop Latent Viroid Detection, Infectivity, Host Range, and Transmission. Viruses. 2023; 16(1):30.
Miotti N, Passera A, Ratti C, Dall'Ara M, Casati P. A Guide to Cannabis Virology: From the Virome Investigation to the Development of Viral Biotechnological Tools. Viruses. 2023; 15(7):1532.
Punja ZK, Wang K, Lung S, Buirs L. Symptomology, prevalence, and impact of Hop latent viroid on greenhouse-grown cannabis (Cannabis sativa L.) plants in Canada. Can J Plant Pathol. 2023; 46(2):174-97.
Punja ZK, Kahl D, Reade R, Xiang Y, Munz J, Nachappa P. Challenges to Cannabis sativa Production from Pathogens and Microbes-The Role of Molecular Diagnostics and Bioinformatics. Int J Mol Sci. 2023; 25(1):14.
Buirs L, Punja ZK. Integrated Management of Pathogens and Microbes in Cannabis sativa L. (Cannabis) under Greenhouse Conditions. Plants (Basel). 2024; 13(6):786.
Wang S. Diagnosing Hemp and Cannabis Crop Diseases. 2021. CABI, Boston.
Beaudry D, Perreault JP. An efficient strategy for the synthesis of circular RNA molecules. Nucleic Acids Res. 1995; 23(15):3064-6.
Micura R. Cyclic oligoribonucleotides (RNA) by solid-phase synthesis. Chem A Eur J. 1999; 5(7):2077-82.
Petkovic S, Müller S. RNA circularization strategies in vivo and in vitro. Nucleic Acids Res. 2015; 43(4):2454-65.
Xu MQ, Kathe SD, Goodrich-Blair H, Nierzwicki-Bauer SA, Shub DA. Bacterial origin of a chloroplast intron: conserved self-splicing group I introns in cyanobacteria. Science. 1990; 250(4987):1566-70.
Cech TR. Self-splicing of group I introns. Annu Rev Biochem. 1990; 59:543-68.
Cech TR, Bass BL. Biological catalysis by RNA. Annu Rev Biochem. 1986; 55:599-629.
Zaug AJ, McEvoy MM, Cech TR. Self-splicing of the group I intron from Anabaena pre-tRNA: requirement for base-pairing of the exons in the anticodon stem. Biochemistry. 1993; 32(31):7946-53.
Gomes RMODS, Silva KJGD, Theodoro RC. Group I introns: Structure, splicing and their applications in medical mycology. Genet Mol Biol. 2024; 47Suppl 1(Suppl 1):e20230228.
Citti L, Rainaldi G. Synthetic hammerhead ribozymes as therapeutic tools to control disease genes. Curr Gene Ther. 2005; 5(1):11-24.
Edwards K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 1991; 19(6):1349.
Rausch JW, Heinz WF, Payea MJ, Sherpa C, Gorospe M, Le Grice SFJ. Characterizing and circumventing sequence restrictions for synthesis of circular RNA in vitro. Nucleic Acids Res. 2021; 49(6):e35.
Gruber AR, Lorenz R, Bernhart SH, Neuböck R, Hofacker IL. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. 2008; 36(Web Server issue):W70-4.
Lorenz R, Bernhart SH, Höner Zu Siederdissen C, Tafer H, Flamm C, Stadler PF, Hofacker IL. ViennaRNA Package 2.0. Algorithms Mol Biol. 2011; 6:26.
Ortolá B, Daròs JA. Viroids: Non-Coding Circular RNAs Able to Autonomously Replicate and Infect Higher Plants. Biology (Basel). 2023; 12(2):172.
