Оптимізація протоколу збірки нуклеосом з використанням гістонів і модельних ДНК-дуплексів і оцінка ефективності процесу реконструкції
DOI:
https://doi.org/10.7124/bc.00099AКлючові слова:
збірка нуклеосомних корових частинок, хроматин, корові гістониАнотація
Нуклеосомна корова частка, НКЧ, являє собою зручну модельну систему для вивчення ключових ДНК-залежних процесів, оскільки є елементарною одиницею структури хроматину. Саме тому основним завданням представленого дослідження було створення універсального методу збірки нуклеосом. Для реконструкції НКЧ використовуються очищені гістони і ДНК-структури з певними послідовностями, що забезпечують чітке позиціонування ДНК відносно октамера гістонів. Це вимагає наявності способу контролю ефективності реконструкції НКЧ. Мета. Оптимізувати процедуру реконструкції НКЧ з очищених октамер гістонів і різних типів синтезованих модельних ДНК і запропонувати підхід для експрес-аналізу ефективності цього процесу. Методи. Діаліз, поділ в ПААГ, вимір флуоресценції з використанням барвника Eva-Green. Результати. Ми розробили зручну процедуру складання НКЧ в слабо сольовому буфері із змінним співвідношенням ДНК-гістони на першому етапі. Після визначення оптимального співвідношення реконструкція НКЧ може бути проведена за допомогою повільного градиентного діалізу. На цьому етапі ефективність процесу може бути оцінена безпосередньо в розчині з використанням барвника Eva-Green. Висновки. Було показано, що ефективність интеркаляции барвника в дуплекс ДНК в контексті нуклеосоми різко знижується. До основних переваг запропонованого підходу можна віднести швидкий аналіз суміші безпосередньо в розчині і можливість використання ДНК, що не містять будь-яких спеціальних міток.Посилання
MacAlpine DM, Almouzni G. Chromatin and DNA replication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(8):a010207.
Balliano AJ, Hayes JJ. Base excision repair in chromatin: Insights from reconstituted systems. DNA Repair (Amst). 2015;36:77-85.
Lee J, Crickard JB, Reese JC, Lee TH. Single-molecule FRET method to investigate the dynamics of transcription elongation through the nucleosome by RNA polymerase II. Methods. 2019 Jan 17. pii: S1046-2023(18)30293-7.
Osterman LA. Chromatography of proteins and nucleic acids. Moscow: Nauka, 1985. 536 p.
Simon RH, Felsenfeld G. A new procedure for purifying histone pairs H2A + H2B and H3 + H4 from chromatin using hydroxylapatite. Nucleic Acids Res. 1979;6(2):689-96.
Schnitzler GR. Isolation of histones and nucleosome cores from mammalian cells. Curr Protoc Mol Biol. 2001;Chapter 21:Unit 21.5.
Peterson CL, Hansen JC. Chicken erythrocyte histone octamer preparation. CSH Protoc. 2008;2008:pdb.prot5112.
Lowary PT, Widom J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 1998;276(1):19-42.
Cannan WJ, Tsang BP, Wallace SS, Pederson DS. Nucleosomes suppress the formation of double-strand DNA breaks during attempted base excision repair of clustered oxidative damages. J Biol Chem. 2014;289(29):19881-93.
Hinz JM. Impact of abasic site orientation within nucleosomes on human APE1 endonuclease activity. Mutat Res. 2014;766-767:19-24.
Green RM, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 4th edition. 2012: 2028
Mao F, Leung WY, Xin X. Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol. 2007;7:76.
