Суперсинте з та очищенн я метіонінамінопептидази Escherichia coli
DOI:
https://doi.org/10.7124/bc.00065CАнотація
Метіонінамінопептидази (МАР) відіграють важливу роль у процесінгу білка. Вони вибірково видаляють N-кінцевий метіонін у поліпептиду як в еу-, так і прокаріотичних клітинах. Однак при отриманні гетерологічних білків у бактеріях додатковий N-кінцевий метіонін часто не відщеплюється. Якщо рекомбінантні білки передбачається застосовувати у клініці, то дуже важливо, щоб кінцевий продукт був ідентичним природному аналогу, инакше в нього можуть бути антигенні властивості. Тому додатковий N-кіниевий залишок метіоніну бажано видалити, що можна здійснити in vitro, обробивши рекомбінантний білок препаратом очищеної МАР Е. coli. У цій роботі розроблено ефективний метод отримання даного ферменту з використанням системи експресії на основі РНК-полімерази фага Т7. Показано, що при культивуванні продуцента MAP BL (рЕТ-МАР) за температури 37 °С цільовий білок накопичується переважно в нерозчинній формі з виходом 17 % від сумарних клітинних білків. Однак якщо клітини штам у-продуцента інфікувати фагом лямбда, то одержаний лізат буде вміщувати МАР у розчинній формі в значно більшій кількості, ніж неінфіковані клітини. В результаті оптимізації таких параметрів, як оптична густина культури при зараженні і наступна температура культивування продуцента, досягнуто вихід цільового білка в кількості, що перевищує 40 % від розчинних білків, або 0,8 г/л. Рекомбінантний білок очищено з використанням іонообмінної хроматографії до гомогенності більше 90 %.Посилання
Datta B. MAPs and POEP of the roads from prokaryotic to eukaryotic kingdoms. Biochimie. 2000;82(2):95-107.
Ben-Bassat A, Bauer K, Chang SY, Myambo K, Boosman A, Chang S. Processing of the initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionine aminopeptidase and its gene structure. J Bacteriol. 1987;169(2):751-7.
Hirel PH, Schmitter MJ, Dessen P, Fayat G, Blanquet S. Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(21):8247-51.
Dalb?ge H, Bayne S, Pedersen J. In vivo processing of N-terminal methionine in E. coli. FEBS Lett. 1990;266(1-2):1-3.
Vassileva-Atanassova A, Mironova R, Nacheva G, Ivanov I. N-terminal methionine in recombinant proteins expressed in two different Escherichia coli strains. J Biotechnol. 1999;69(1):63-7.
Sandman K, Grayling RA, Reeve JN. Improved N-terminal processing of recombinant proteins synthesized in Escherichia coli. Biotechnology (N Y). 1995;13(5):504-6.
Solbiati J, Chapman-Smith A, Miller JL, Miller CG, Cronan JE Jr. Processing of the N termini of nascent polypeptide chains requires deformylation prior to methionine removal. J Mol Biol. 1999;290(3):607-14.
Warren WC, Bentle KA, Schlittler MR, Schwane AC, O'Neil JP, Bogosian G. Increased production of peptide deformylase eliminates retention of formylmethionine in bovine somatotropin overproduced in Escherichia coli. Gene. 1996;174(2):235-8.
Slavchenko IYu, Boreyko EV, Gavrysh TG, Kostyuchenko IP, Kordyum VA. Biosynthesis of human basic fibroblast growth factor in soluble form in Escherichia coli and its purification. Biopolym Cell. 2003; 19(2):179-84.
Chalmers JJ, Kim E, Telford JN, Wong EY, Tacon WC, Shuler ML, Wilson DB. Effects of temperature on Escherichia coli overproducing beta-lactamase or human epidermal growth factor. Appl Environ Microbiol. 1990;56(1):104-11.
Slavchenko IYu. The influence of temperature on the yield soluble human alpha interferon in the system of recombinant proteins overproduction using bacteriophage lambda. Biopolym Cell. 2002; 18(5):436-41.
Cohen SN, Chang AC. Genetic expression in bacteriophage lambda. 3. Inhibition of Escherichia coli nucleic acid and protein synthesis during lambda development. J Mol Biol. 1970;49(3):557-75.
Drahos DJ, Hendrix RW. Effect of bacteriophage lambda infection on synthesis of groE protein and other Escherichia coli proteins. J Bacteriol. 1982;149(3):1050-63.
Kochan J, Murialdo H. Stimulation of groE synthesis in Escherichia coli by bacteriophage lambda infection. J Bacteriol. 1982;149(3):1166-70.
Polissi A, Goffin L, Georgopoulos C. The Escherichia coli heat shock response and bacteriophage lambda development. FEMS Microbiol Rev. 1995;17(1-2):159-69.
Lee KH, Kim HS, Jeong HS, Lee YS. Chaperonin GroESL mediates the protein folding of human liver mitochondrial aldehyde dehydrogenase in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun. 2002;298(2):216-24.
Chao YP, Chiang CJ, Lo TE, Fu H. Overproduction of D-hydantoinase and carbamoylase in a soluble form in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 2000;54(3):348-53.
Caspers P, Stieger M, Burn P. Overproduction of bacterial chaperones improves the solubility of recombinant protein tyrosine kinases in Escherichia coli. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 1994;40(5):635-44.
Luo ZH, Hua ZC. Increased solubility of glutathione S-transferase-P16 (GST-p16) fusion protein by co-expression of chaperones groes and groel in Escherichia coli. Biochem Mol Biol Int. 1998;46(3):471-7.
Machida S, Yu Y, Singh SP, Kim JD, Hayashi K, Kawata Y. Overproduction of beta-glucosidase in active form by an Escherichia coli system coexpressing the chaperonin GroEL/ES. FEMS Microbiol Lett. 1998;159(1):41-6.
Widersten M. Heterologous expression in Escherichia coli of soluble active-site random mutants of haloalkane dehalogenase from Xanthobacter autotrophicus GJ10 by coexpression of molecular chaperonins GroEL/ES. Protein Expr Purif. 1998;13(3):389-95.
