Використання дріжджової двогібридної системи для пошуку S6K1 та S6K2 зв'язуючих партнерів
DOI:
https://doi.org/10.7124/bc.0005EFАнотація
Кіназа рибосомного білка S6 (S6K) задіяна в сигнальних механізмах регуляції проліферації, диференціації та клітинного росту. На сьогодні відомо дві форми S6K (S6K1 та 2), які мають цитоплазматичний та ядерний сплайсингові варіанти. Відомо лише декілька фізіологічних субстратів S6K і партнерів її білково-білкової взаємодії. Для пошуу нових партнерів взаємодії з S6K1 та 2 нами використано дріжджову двогібридну систему. За допомогою аналізу шести створених "bait"-конструктів виявлено, що тільки повнорозмірна форма S6K1 відповідала вимогам двогібридного скринінгу. Великомасштабний скринінг кДНКової бібліотеки ембріона миші дозволив нам виявити 26 позитивних клонів, 13 з яких підтверджено методом статевого злиття. Рестрикційні дослідження і аналіз послідовностей даних клонів показали, що всі вони містять кДНК розміром близько 4000 п. н. з однаковою картиною рестрикції та послідовностями на 5'- та 3'-кінцях. Порівняння отриманих послідовностей з геномными та білковими банками даних засвідчило, що кДНК одержаних клонів кодує фрагмент нового білка. Первинна структура даного білка та особливості його взаємодії з S6K знаходяться в процесі вивчення.Посилання
Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 1995;59(1):94-123.
Gyuris J, Golemis E, Chertkov H, Brent R. Cdi1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell. 1993;75(4):791-803.
Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(21):9578-82.
Vojtek AB, Hollenberg SM, Cooper JA. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 1993;74(1):205-14.
Wang T, Donahoe PK, Zervos AS. Specific interaction of type I receptors of the TGF-beta family with the immunophilin FKBP-12. Science. 1994;265(5172):674-6.
Shih HM, Goldman PS, DeMaggio AJ, Hollenberg SM, Goodman RH, Hoekstra MF. A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions: identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(24):13896-901.
Dufner A, Thomas G. Ribosomal S6 kinase signaling and the control of translation. Exp Cell Res. 1999;253(1):100-9.
Lane HA, Fernandez A, Lamb NJ, Thomas G. p70s6k function is essential for G1 progression. Nature. 1993;363(6425):170-2.
Gout I, Minami T, Hara K, Tsujishita Y, Filonenko V, Waterfield MD, Yonezawa K. Molecular cloning and characterization of a novel p70 S6 kinase, p70 S6 kinase beta containing a proline-rich region. J Biol Chem. 1998;273(46):30061-4.
Chou MM, Blenis J. The 70 kDa S6 kinase complexes with and is activated by the Rho family G proteins Cdc42 and Rac1. Cell. 1996;85(4):573-83.
Peterson RT, Desai BN, Hardwick JS, Schreiber SL. Protein phosphatase 2A interacts with the 70-kDa S6 kinase and is activated by inhibition of FKBP12-rapamycinassociated protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(8):4438-42.
Akimoto K, Nakaya M, Yamanaka T, Tanaka J, Matsuda S, Weng QP, Avruch J, Ohno S. Atypical protein kinase Clambda binds and regulates p70 S6 kinase. Biochem J. 1998;335 (Pt 2):417-24.
Miller JH. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, 466 p.
Estojak J, Brent R, Golemis EA. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Mol Cell Biol. 1995;15(10):5820-9.
Berry DR. The Biology of Yeasts. Hodder & Stoughton Educational. 1982; 64 p.
