Biopolym. Cell. 2020; 36(3):210-228.
Геномика, транскриптомика и протеомика
Ответ опухолевых клеток с редактированной экспрессией S6K1 на воздействие опухолевого микроокружения.
1Гоцуляк Н. Я., 1, 2Кравченко А. О., 1Косач В. Р., 1Тихонкова И. А., 1Хоруженко А. И.
  1. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
    ул. Академика Заболотного, 150, Киев, Украина, 03143
  2. Учебно-научный центр «Институт биологии и медицины»
    Киевского национального университета имени Тараса Шевченко
    ул. Владимирская, 64/13, Киев, Украина, 01601

Abstract

Цель. Исследовать участие mTOR/S6K1 сигнальной сети опухолевых клеток в их ответе на регуляторное влияние фибробластов. Методы. культура клеток, включая со-культивирование фибробластов и опухолевых клеток, иммунофлуоресцентный анализ, вестерн-блот-анализ, оценка миграционной активности опухолевых клеток методом царапин и преобразования многоклеточного сфероида в однослойную клеточную колонию. Результаты. Представленная работа продемонстрировала положительное влияние стромальных клеток на уровень фосфорилирования звеньев mTOR / S6K1 сигнального каскада: p85S6K1, p70S6K1 и mTOR опухолевых клеток линии MCF-7. Чтобы определить, какая из изоформ S6K1: p85S6K1, p70S6K1 или p60S6K1 может быть наиболее чувствительной к действию внеклеточногоокружения, были использованы стабильные клеточные линии на основе клеток MCF-7 с редактированной экспрессией изоформ S6K1. Таким образом, было установлено, что селективная экспрессия p60S6K1 приводила к изменению морфологических особенностей опухолевых клеток в условиях двух- и трехмерной культуры. Эти клетки также демонстрировали высокий уровень фосфорилирования киназы фокальной адгезии и высокое содержание белков Zo-1, CD29, CD44, что объясняет их высокий миграционный потенциал в тесте на царапины. Кроме того, клетки, селективно экспрессирующие p60S6K1, были устойчивыми как к факторам, которые продуцируют фибробласты так и к рапамицину. Также, было продемонстрировано, что фибробласты повышают подвижность опухолевых клеток в тесте на царапины и распластывание сфероидов в условиях со-культивирования паракринным путем, тогда как непосредственный контакт опухолевых сфероидов с монослоем фибробластов значительно снижал скорость распластывание сфероидов. Выводы. Анализ поведения опухолевых клеток с измененной экспрессией изоформ S6K1 обнаружил, что для жизнедеятельности клеток и их ответа на факторы микроокружения важны не только экспрессия определенных изоформ, но и их соотношение в клетке.
Keywords: S6K1, миграция, опухолевое микроокружение

References

[1] Truffi M, Sorrentino L, Corsi F. Fibroblasts in the Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 2020;1234:15-29.
[2] Alkasalias T, Moyano-Galceran L, Arsenian-Henriksson M, Lehti K. Fibroblasts in the Tumor Microenvironment: Shield or Spear? Int J Mol Sci. 2018;19(5):1532.
[3] Erdogan B, Webb DJ. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochem Soc Trans. 2017;45(1):229-236.
[4] Degeorges A, Tatoud R, Fauvel-Lafeve F, Podgorniak MP, Millot G, de Cremoux P, Calvo F. Stromal cells from human benign prostate hyperplasia produce a growth-inhibitory factor for LNCaP prostate cancer cells, identified as interleukin-6. Int J Cancer. 1996;68(2):207-14.
[5] Ren J, Smid M, Iaria J, Salvatori DCF, van Dam H, Zhu HJ, Martens JWM, Ten Dijke P. Cancer-associated fibroblast-derived Gremlin 1 promotes breast cancer progression. Breast Cancer Res. 2019;21(1):109.
[6] Matsumura Y, Ito Y, Mezawa Y, Sulidan K, Daigo Y, Hiraga T, Mogushi K, Wali N, Suzuki H, Itoh T, Miyagi Y, Yokose T, Shimizu S, Takano A, Terao Y, Saeki H, Ozawa M, Abe M, Takeda S, Okumura K, Habu S, Hino O, Takeda K, Hamada M, Orimo A. Stromal fibroblasts induce metastatic tumor cell clusters via epithelial-mesenchymal plasticity. Life Sci Alliance. 2019;2(4):e201900425.
[7] Balkwill FR, Capasso M, Hagemann T. The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci. 2012;125(Pt 23):5591-6.
[8] Aoki M, Fujishita T. Oncogenic Roles of the PI3K/AKT/mTOR Axis. Curr Top Microbiol Immunol. 2017;407:153-189.
[9] Sridharan S, Basu A. Distinct Roles of mTOR Targets S6K1 and S6K2 in Breast Cancer. Int J Mol Sci. 2020;21(4):1199.
[10] Sridharan S, Basu A. Distinct Roles of mTOR Targets S6K1 and S6K2 in Breast Cancer. Int J Mol Sci. MDPI AG; 2020;21(4):1199.
[11] Ben-Hur V, Denichenko P, Siegfried Z, Maimon A, Krainer A, Davidson B, Karni R. S6K1 alternative splicing modulates its oncogenic activity and regulates mTORC1. Cell Rep. 2013;3(1):103-15.
[12] Zaiets IV, Sivchenko AS, Khoruzhenko AI, Filonenko VV.Generation of HEK-293 stable cell lines with disrupted expression of ribosomal protein S6 kinase (S6K1) isoforms using the CRISPR/Cas9 genome editing system. Biopolym Cell. 2017; 33(5):356-66.
[13] Holiar VV, Gotsulyak NYa, Khoruzhenko AI, Zaiets IV.Generation and characterization of the MCF-7 cell line with a knockout of a p85-S6K1 isoform of the ribosomal protein S6 kinase 1. Biopolym Cell. 2019; 35(4):303-312.
[14] Kosach VR, Hotsuliak NYa, Zaiets IV, Skorohod OM, Savinska LO, Khoruzhenko AI, Filonenko VV. Alterations in S6K1 isoforms expression in MCF-7 cell have strong impact on the locomotor activity as well as on S6K1 and Akt signaling. Biopolym Cell. 2020; 36(2):3-4.
[15] Choi J, Yoon YN, Kim N, Park CS, Seol H, Park IC, Kim HA, Noh WC, Kim JS, Seong MK. Predicting Radiation Resistance in Breast Cancer with Expression Status of Phosphorylated S6K1. Sci Rep. 2020;10(1):641.
[16] Song J, Richard S. Sam68 Regulates S6K1 Alternative Splicing during Adipogenesis. Mol Cell Biol. 2015;35(11):1926-39.
[17] Ip CKM, Cheung ANY, Ngan HYS, Wong AST. p70 S6 kinase in the control of actin cytoskeleton dynamics and directed migration of ovarian cancer cells. Oncogene; 2011;30(21):2420-32.
[18] Tavares MR, Pavan ICB, Amaral CL, Meneguello L, Luchessi AD, Simabuco FM. The S6K protein family in health and disease. Life Scie. 2015; 131, 1-10.
[19] Amaral CL, Freitas LB, Tamura RE, Tavares MR, Pavan IC, Bajgelman MC, Simabuco FM. S6Ks isoforms contribute to viability, migration, docetaxel resistance and tumor formation of prostate cancer cells. BMC Cancer. 2016;16:602.
[20] Zhou HY, Wong AS. Activation of p70S6K induces expression of matrix metalloproteinase 9 associated with hepatocyte growth factor-mediated invasion in human ovarian cancer cells. Endocrinology. 2006;147(5):2557-66.
[21] Li H, Zhang Q, Wu Q, Cui Y, Zhu H, Fang M, Zhou X, Sun Z, Yu J. Interleukin-22 secreted by cancer-associated fibroblasts regulates the proliferation and metastasis of lung cancer cells via the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Am J Transl Res. 2019;11(7):4077-4088.
[22] Tommelein J, De Vlieghere E, Verset L, Melsens E, Leenders J, Descamps B, et al. Radiotherapy-Activated Cancer-Associated Fibroblasts Promote Tumor Progression through Paracrine IGF1R Activation. Cancer Res Am Ass Cancer Res (AACR); 2017;78(3):659-70.
[23] von Ahrens D, Bhagat TD, Nagrath D, Maitra A, Verma A. The role of stromal cancer-associated fibroblasts in pancreatic cancer. J Hematol Oncol. 2017;10(1):76.
[24] Nizheradze KA. Binding of wheat germ agglutin into extracellular network produced by cultured human fibroblasts. Folia Histochem Cytobiol.2000;38(4):167-73
[25] de Chaumont F, Dallongeville S, Chenouard N, Hervé N, Pop S, Provoost T, Meas-Yedid V, Pankajakshan P, Lecomte T, Le Montagner Y, Lagache T, Dufour A, Olivo-Marin JC. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nat Methods. 2012;9(7):690-6
[26] Gotsulyak NYa, Kosach VR, Cherednyk OV, Tykhonkova IO, Khoruzhenko AI.Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolym Cell. 2014; 30(3):223-228.
[27] Kravchenko AO, Kosach VR, Shkarina KA, Zaiets IV, Tykhonkova IO, Khoruzhenko A I. Optimization of in vitro model for analysis of tumor cell migration dynamics. Biopolym Cell. 2018; 34(6):476-486.
[28] Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, Preibisch S, Rueden C, Saalfeld S, Schmid B, Tinevez JY, White DJ, Hartenstein V, Eliceiri K, Tomancak P, Cardona A. Fiji: an open-source plat-form for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676-82.
[29] Savinska LO, Kijamova RG, Pogrebnoy PV, Ovcharenko GV, Gout IT, Filonenko VV. Comparative characterization of S6 kinase α and β isoforms expression in mammalian tissues. Biopolym Cell. 2001; 17(5):374-9.
[30] Sulzmaier FJ, Jean C, Schlaepfer DD. FAK in cancer: mechanistic findings and clinical applications. Nat Rev Cancer. 2014;14(9):598-610.
[31] Tancioni I, Miller NL, Uryu S, Lawson C, Jean C, Chen XL, Kleinschmidt EG, Schlaepfer DD. FAK activity protects nucleostemin in facilitating breast cancer spheroid and tumor growth. Breast Cancer Res. 2015;17:47.
[32] Zheng Y, Lu Z. Paradoxical roles of FAK in tumor cell migration and metastasis. Cell Cycle. 2009;8(21):3474-9.
[33] Shorning BY, Griffiths D, Clarke AR. Lkb1 and Pten synergise to suppress mTOR-mediated tumorigenesis and epithelial-mesenchymal transition in the mouse bladder. PLoS One. 2011;6(1):e16209.
[34] Puighermanal E, Biever A, Pascoli V, Melser S, Pratlong M, Cutando L, Rialle S, Severac D, Boubaker-Vitre J, Meyuhas O, Marsicano G, Lüscher C, Valjent E. Ribosomal Protein S6 Phosphorylation Is Involved in Novel-ty-Induced Locomotion, Synaptic Plasticity and mRNA Translation. Front Mol Neurosci. 2017;10:419.
[35] Wang Y, McNiven MA. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. J Cell Biol. 2012;196(3):375-85.
[36] Yom CK, Noh DY, Kim WH, Kim HS. Clinical significance of high focal adhesion kinase gene copy number and overexpression in invasive breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2011;128(3):647-55.
[37] Theocharis SE, Klijanienko JT, Padoy E, Athanassiou S, Sastre-Garau XX. Focal adhesion kinase (FAK) immunocytochemical expression in breast ductal invasive carcinoma (DIC): correlation with clinicopathological parameters and tumor proliferative capacity. Med Sci Monit. 2009;15(8):BR221-6.
[38] McLean GW, Carragher NO, Avizienyte E, Evans J, Brunton VG, Frame MC. The role of focal-adhesion kinase in cancer - a new therapeutic opportunity. Nat Rev Cancer. 2005;5(7):505-15.
[39] Volarević S, Thomas G. Role of S6 phosphorylation and S6 kinase in cell growth. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 2001;65:101-27.
[40] Matsubara M, Bissell MJ. Inhibitors of Rho kinase (ROCK) signaling revert the malignant phenotype of breast cancer cells in 3D context. Oncotarget. 2016;7(22):31602-22.
[41] Kosach V, Shkarina K, Kravchenko A, Tereshchenko Y, Kovalchuk E, Skoroda L, Krotevych M, Khoruzhenko A Nucleocytoplasmic distribution of S6K1 depends on the density and motility of MCF-7 cells in vitro. Version 2. F1000Res. 2018;7:1332.
[42] Savinska LO, Lyzogubov VV, Usenko VS, Ovcharenko GV, Gorbenko ON, Rodnin MV, Vudmaska MI, Pogribniy PV, Kyyamova RG, Panasyuk GG, Nemazanyy IO, Malets MS, Palchevskyy SS, Gout IT, Filonenko VV. Immunohistochemical Analysis of S6K1 and S6K2 Expression in Human Breast Tumors. Eksp Onkol. 2004;26(1):24-30.