Biopolym. Cell. 2002; 18(2):102-109.
Использование дрожжевой двугибридной системы для поиска S6K1 и S6K2 связывающих партнеров
1Живолуп А. Н., 1Немазаный И. А., 1Побигайло Н. В., 1Панасюк А. Г., 1Пальчевский С. С., 1Кухаренко А. П., 1Савинская Л. А., 1Овчаренко Г. В., 1Вудмаска М. И., 1, 2Гут И. Т., 1Мацука Г. Х., 1Филоненко В. В.
  1. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
    ул. Академика Заболотного, 150, Киев, Украина, 03680
  2. Людвиговский институт исследования рака, Лондонское отделение
    91, Райдинг Хаус стрит, Лондон, Великобритания, WIP8BT

Abstract

Киназа рибосомного белка S6 (S6K) причастна к сигнальным механизмам регуляции пролиферации, дифференциации и клеточного роста. На сегодня известны две ее формы (S6K1 и S6K2), имеющие цитоплазматический и ядерный варианты сплайсинга. Известно лишь нескольки физиологических суб­стратов S6K и партнеров ее белково-белкового взаимодейст­вия. Для поиска новых партнеров взаимодействия с S6K1 и 2 нами использована дрожжевая двугибридная система. С по­мощью анализа шести созданных "bait"-конструктов выявле­но, что только полноразмерная форма S6K1 отвечала требо­ваниям двугибридного скрининга. Крупномасштабный скри­нинг кДНКовой библиотеки эмбриона мыши позволил нам выявить 26 позитивных клонов, 13 из которых подтверджены методом полового слияния. Рестрикционные исследования и анализ последовательностей данных клонов показали, что все они содержат кДНК размером около 4000 п. н. с одинаковой картиной рестрикции и последовательностями на 5'- и 3'-концах. Сравнение полученных последовательностей с геномными и белковыми банками данных свидетельствует о том, что кДНК полученных клонов кодирует фрагмент нового белка. Первичная структура данного белка и особенности его взаи­модействия с S6K находятся в процессе изучения.

References

[1] Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 1995;59(1):94-123.
[2] Gyuris J, Golemis E, Chertkov H, Brent R. Cdi1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell. 1993;75(4):791-803.
[3] Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(21):9578-82.
[4] Vojtek AB, Hollenberg SM, Cooper JA. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 1993;74(1):205-14.
[5] Wang T, Donahoe PK, Zervos AS. Specific interaction of type I receptors of the TGF-beta family with the immunophilin FKBP-12. Science. 1994;265(5172):674-6.
[6] Shih HM, Goldman PS, DeMaggio AJ, Hollenberg SM, Goodman RH, Hoekstra MF. A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions: identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(24):13896-901.
[7] Dufner A, Thomas G. Ribosomal S6 kinase signaling and the control of translation. Exp Cell Res. 1999;253(1):100-9.
[8] Lane HA, Fernandez A, Lamb NJ, Thomas G. p70s6k function is essential for G1 progression. Nature. 1993;363(6425):170-2.
[9] Gout I, Minami T, Hara K, Tsujishita Y, Filonenko V, Waterfield MD, Yonezawa K. Molecular cloning and characterization of a novel p70 S6 kinase, p70 S6 kinase beta containing a proline-rich region. J Biol Chem. 1998;273(46):30061-4.
[10] Chou MM, Blenis J. The 70 kDa S6 kinase complexes with and is activated by the Rho family G proteins Cdc42 and Rac1. Cell. 1996;85(4):573-83.
[11] Peterson RT, Desai BN, Hardwick JS, Schreiber SL. Protein phosphatase 2A interacts with the 70-kDa S6 kinase and is activated by inhibition of FKBP12-rapamycinassociated protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(8):4438-42.
[12] Akimoto K, Nakaya M, Yamanaka T, Tanaka J, Matsuda S, Weng QP, Avruch J, Ohno S. Atypical protein kinase Clambda binds and regulates p70 S6 kinase. Biochem J. 1998;335 (Pt 2):417-24.
[13] Miller JH. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, 466 p.
[14] Estojak J, Brent R, Golemis EA. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Mol Cell Biol. 1995;15(10):5820-9.
[15] Berry DR. The Biology of Yeasts. Hodder & Stoughton Educational. 1982; 64 p.