Biopolymers and Cell 27(6) P 436-441
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ, СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI ЛЕЙЦИЛ-ТРНК СИНТЕТАЗЫ THERMUS THERMOPHILUS
1, 2Яремчук А. Д., 1Коваленко О. П.,. 1Гудзера О. И, 1, 2Тукало М. А.
1Государственная ключевая лаборатория молекулярной и клеточной биологии
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
ул. Академика Заболотного, 150, Киев, Украина, 03680
2ЕМБЛ
Ул. Жюли Горовиц, 6, Гренобль, Франция
Цель. Клонирование и секвенирование лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) с последующим созданием генно-инженерной конструкции для экспрессии белка в клетках E. coli и его выделение. Методы. Поиск гена ЛейРСТТ проводили методом Саузерн-блот-гибридизации с хромосомной ДНК, где в качестве зондов использованы меченные дигоксигенином ПЦР-фрагменты ДНК. Результаты. Ген ЛейРС из клеток T. thermophilus HB27 клонирован и секвенирован. Открытая рамка считывания кодирует полипептид длиной 878 аминокислотных остатков (молекулярная масса 101 кДа). Сравнение аминокислотной последовательности ЛейРСТТ с таковыми гомологичных ферментов из других организмов показало, что она входит в группу аналогичных ферментов прокариотов, образуемую белками протобактерий, риккетсий, а также митохондрий эукариотов. Полученное филогенетическое древо Лей РС демонстрирует дихотомическое разветвление на две линии: прокариото/митохондриально-эукариотические и архейно/цитоплазмо-эукариотические белки. Отличия между прокариотической и архейной ветвями филогенетического древа ЛейРС в первую очередь связаны со структурой двух доменов фермента – корректирующего и С-концевого. Для экспрессии гена ЛейРСТТ в клетках E. coli соответствующий ген клонирован в экспресирующий вектор pET29b. Выводы. Клонированный ген leuS T. thermophilus и экспрессирующийся рекомбинантный белок будут использованы для структурно-функциональных исследований ЛейРСТТ, включая рентгеноструктурный анализ фермента и его мутантных форм в комплексе с различными субстратами. Ключевые слова: аминоацил-тРНК синтетазы, лейцил-тРНК синтетаза Thermus thermophilus, филогенетическое древо. |
|